مراقبة وصول البروتينات السطحية الموسومة ب GFP إلى شبكة عبر جولجي باستخدام الأجسام النانوية الوظيفية

الملخص

المصدر: Buser, D.P., et al. تحليل امتصاص الخلايا الداخلية والنقل الرجعي إلى شبكة عبر جولجي باستخدام الأجسام النانوية الوظيفية في الخلايا المستزرعة. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو طريقة لدراسة امتصاص الأجسام النانوية الوظيفية ونقلها إلى الوراء لفهم مسارات الاتجار داخل الخلايا. من خلال إدخال الكبريتات ذات العلامات الإشعاعية واستخدام تقنيات العزل والكشف ، تتيح هذه الطريقة دراسة امتصاص الخلايا الداخلية ووصول شبكة جولجي عبر بروتينات الشحن.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. امتصاص الأجسام النانوية الوظيفية بواسطة الخلايا المستنبتة (لتحليل الكبريتات)

1. في غطاء مزرعة الخلية ، تعبر البذور ~ 400,000 إلى 500,000 خلية هيلا عن بروتين مراسل موسوم ب GFP في أطباق 35 مم أو على مجموعات مكونة من 6 آبار مع وسط كامل يحتوي على مضادات حيوية (وسط النسر المعدل من Dulbecco ، DMEM ، مكمل بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ (FCS) ، 100 وحدة / مل ستربتومايسين ، 2 ملي مولار لجلوتامين ، و 1.5 ميكروغرام / مل بوروميسين><). ملاحظه: كما ذكرنا أعلاه ، نستخدم هنا خلايا HeLa التي تعبر بثبات عن EGFP-Calnexin و EGFP-CDMPR و TfR-EGFP لأغراض التوضيح. بصرف النظر عن خطوط الخلايا المستقرة ، يمكن أيضا استخدام HeLa المنقولة بشكل عابر.
2. احتضان الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{7.5٪ 2} للتكاثر.
   ملاحظه: يجب أن يكون للخلايا التقاء ~ 80٪ في اليوم التالي.
3. قم بإزالة الوسط الكامل ، واغسله مرتين باستخدام 1x PBS في RT ، وقم بتجويع الخلايا بوسط خال من الكبريتات (SFM) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ بنسبة 7.5٪.
   ملاحظه: يتم تحضير SFM عن طريق إضافة 10 مل من محلول الأحماض الأمينية MEM (50x) ، و 5 مل من L-glutamine (200 مليمتر) ، و 5 مل من محلول الفيتامينات (100x) ، و 900 ميكرولتر من CaCl₂ · 2 ساعة₂O إلى 500 مل من أملاح النسر المتوازنة. تمر عبر مرشح 0.22 ميكرومتر وحصة.
4. في غطاء أو مقعد جيد التهوية مخصص لأعمال النشاط الإشعاعي ، قم بإعداد وسيط وضع العلامات على الكبريتات يحتوي على 0.5 ملي Ci / مل [³⁵S] كبريتات كملح صوديوم في SFM.
   أنذر: تعامل بعناية مع جميع المحاليل التي تحتوي على نشاط إشعاعي. العمل فقط في أغطية أو مقاعد مخصصة. يجب جمع جميع المواد (الأطراف ، الأنابيب ، الألواح ، إلخ) أو مخازن الغسيل الملامسة للنشاط الإشعاعي والتخلص منها بشكل منفصل. قم بذلك لجميع الخطوات أدناه (الخطوات 1.5-1.18) أيضا.
5. أضف VHH-2xTS في 1x PBS إلى وسط وضع العلامات على الكبريتات إلى تركيز نهائي قدره 2 ميكروغرام / مل
   ملاحظه: كعنصر تحكم ، قم أيضا بتضمين VHH-std أو جسم نانوي آخر خال من مواقع TS لإظهار وضع علامات محددة.
6. يستعاض عن SFM ب 0.7 مل من وسط وضع العلامات على الكبريتات التي تحتوي على 0.5 mCi/mL [35S] كبريتات و 2 ميكروغرام/مل VHH-2xTS واحتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة_CO2 بنسبة 7.5٪ مخصصة للعمل مع النشاط الإشعاعي.
   ملاحظه: اعتمادا على التجربة المخطط لها ، يجب تعديل وقت كبريتات الجسم النانوي. بالإضافة إلى ذلك ، لتحديد حركية وصول TGN ، يتم إجراء الملصقات لأوقات مختلفة (على سبيل المثال ، لمدة 10 دقائق ، 20 دقيقة ، 30 دقيقة ، إلخ).
7. قم بإزالة وسيط الملصقات واغسل الخلايا 2-3 مرات باستخدام 1x PBS المثلج على طبق تبريد أو ثلج.
8. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للتحلل (PBS يحتوي على 1٪ Triton X-100 و 0.5٪ deoxycholate) مكملا ب 2 ملي مولار PMSF و 1x كوكتيل مثبط للبروتياز واحتضان الخلايا لمدة 10-15 دقيقة على منصة هزازة عند 4 درجات مئوية.
9. اكشط المحللة وانقلها إلى أنبوب سعة 1.5 مل ، وقم بدوامة المحللة ، وضعها لمدة 10-15 دقيقة على دوار من طرف إلى طرف عند 4 درجات مئوية.
10. قم بإعداد محللة ما بعد النواة عن طريق الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
11. باستخدام أنبوب جديد سعة 1.5 مل ، قم بإعداد 20-30 ميكرولتر من ملاط حبات النيكل في أنبوب سعة 1.5 مل واغسلها مرة واحدة باستخدام 1x PBS عن طريق تكويرها برفق عند 1,000 × جم لمدة 1 دقيقة
    ملاحظه: بدلا من حبات النيكل ، يمكن استخدام حبات الستربتافيدين (إذا كان الجسم النانوي بيوتينيلي) أو حبات البروتين A مع IgG مقابل حاتمة الجسم النانوي (T7- أو HA-tag).
12. انقل المحللة بعد النووية إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على حبات النيكل واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية على محور دوار نهائي لعزل الأجسام النانوية. قم بإزالة كمية (50-100 ميكرولتر) من محللة ما بعد النواة واغليها في المخزن المؤقت لعينة SDS لتحليل اللطخة المناعية اللاحقة للجسم النانوي الكلي المرتبط بالخلية ، ومراسل GFP ، والتحكم في التحميل.
13. اغسل الخرزات 3 مرات باستخدام 1x PBS أو المخزن المؤقت للتحلل عن طريق التكوير برفق عند 1,000 × جم لمدة 1 دقيقة < / > ملاحظه: لغسل أكثر صرامة للحبات ، يمكن تضمين 20 ملي مولار إيميدازول في PBS أو المخزن المؤقت للتحلل.
14. قم بإزالة كل عازلة الغسيل بعناية من الخرزات ، وأضف 50 ميكرولتر من 2x عينة مؤقتة ، واتركها تغلي لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية.
15. قم بتحميل كل من الخرزات المسلوقة على جل متوسط 12.5٪ SDS-PAGE وقم بتشغيله وفقا لبروتوكول PAGE القياسي حتى تصل الصبغة المرجعية (على سبيل المثال ، البروموفينول الأزرق) إلى نهاية الجل الفاصل.
    ملاحظه: يمكن أيضا إجراء تحليل اللطخة المناعية للجسم النانوي الكلي المرتبط بالخلية ، ومراسل GFP ، والتحكم في التحميل باستخدام جل SDS-PAGE صغير بنسبة 12.5٪ أو جل متدرج مسبقة الصب.
16. قم بإصلاح الجل الفاصل في ~ 30 مل من المخزن المؤقت للتثبيت (10٪ حمض الأسيتيك و 45٪ ميثانول في ddH₂O) لمدة ساعة واحدة في RT ، اغسل الجل ثلاث مرات ب ~ 50 مل من الماء منزوع الأيونات ، واستعد لتجفيف الجل.
17. تجفيف المواد الهلامية SDS-PAGE.​
    1. ضع الجل الثابت بعناية على فيلم بلاستيكي ممتد وقم بتغطيته بورق ترشيح مقطوع مسبقا.
    2. ضع الجل مع ورق الترشيح لأسفل أعلى منصة التجفيف ، ضع غطاء التفريغ ، وقم بتشغيل مضخة التفريغ لتجفيف الجل. جفف الجل لمدة 3-5 ساعات.
    3. قم بإزالة ورق التغليف وضع الجل المجفف في شريط التصوير الشعاعي الذاتي المزود بشاشة فوسفور.
تصوير
18. التصوير الشعاعي للصور باستخدام جهاز تصوير شاشة الفوسفور. اتبع تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظه: اعتمادا على قوة الإشارة ، يجب أن تتعرض المواد الهلامية المجففة لفترة أطول باستخدام شاشات الفوسفور.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الأجسام المضادة ل GFP سيجما ألدريتش 1.18145ه إ + 11 يتم توزيع المنتج بواسطة SigmaAldrich ، ولكن تم تصنيعه بواسطة Roche وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) سيجما ألدريتش مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) الغرب الحيوي الكبريت -35 في صورة كبريتات الصوديوم تحليلات هارتمان ARS0105 يحتوي المنتج على 5 ملي سي 6 أطباق جيدة برنامج النقاط التجارية 92406 بارافورمالدهايد (PFA) أبليشم أ 3813 فلوروماونت-جي التكنولوجيا الحيوية الجنوبية 0100-01 جل Mini-Protean TGX ، 4-20٪ ، 15 جيدا بيو راد 456-1096