اختبار لقياس البلعمة بوساطة الأجسام المضادة لكريات الدم الحمراء المصابة بالطفيليات

الملخص

المصدر: Quintana ، M. d. P. et al. ، قياس الأجسام المضادة المحفزة للبلعمة المكتسبة بشكل طبيعي لطفيليات المتصورة المنجلية عن طريق الفحص القائم على قياس التدفق الخلوي.J. Vis. Exp.(2020)

يوضح هذا الفيديو مقايسة البلعمة القائمة على قياس التدفق الخلوي التي تتضمن كريات الدم الحمراء المصابة بالمتصورة المنجلية المصنفة والمصابة بالبصيلة بواسطة الخلايا الوحيدة. يحدد قياس التدفق الخلوي التألق في الخلايا الوحيدة ، مما يؤكد التحديد الناجح لكريات الدم الحمراء المنحلة من خلال البلعمة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. ثقافة الطفيليات

ملاحظة: اتبع اللوائح المحلية للتعامل مع مسببات الأمراض البشرية.

1. الحفاظ على طفيليات المتصورة المنجلية وفقا للبروتوكول القياسي كما هو موضح سابقا في وسط زراعة الطفيليات (انظر جدول المواد).
2. حافظ على مزامنة الطفيليات بإحكام باستخدام علاج السوربيتول كما هو موضح سابقا.
3. لضمان التعبير VAR2CSA على سطح كريات الدم الحمراء المصابة بالمتصورة المنجلية (IE) ، قم بإجراء جولات متكررة من الانتقاء المناعي المغناطيسي باستخدام جسم مضاد مضاد VAR2CSA (على سبيل المثال ، الجسم المضاد PAM1.4 ، وهو IgG أحادي النسيلة VAR2CSA خاص بالبروتين) مقترن بخرز البروتين G.
   1. باختصار ، احتضان التروفوزويت IEs في المرحلة المتأخرة مع الخرز المغناطيسي المقترن بجسم مضاد مضاد VAR2CSA وحدد بشكل إيجابي باستخدام المغناطيس.
   2. قم بتوسيع الطفيليات المحددة في المزرعة لبضع دورات حتى تصل الطفيليات إلى 5٪ على الأقل.
   3. بدلا من ذلك ، حدد الطفيليات التي ترتبط ب CSA الثابت بالبلاستيك (مستقبل VAR2CSA) كما هو موضح سابقا.
4. للتحقق من VAR2CSA التعبير على الطفيليات المحددة ، قم بإجراء قياس التدفق الخلوي كما هو موضح سابقا.
   1. باختصار ، قم بتسمية التروفوزويت-IEs في المرحلة المتأخرة بنفس الجسم المضاد المستخدم في الاختيار المغناطيسي (الخطوة 1.3) متبوعا بجسم مضاد ثانوي مصنف بالفلورسنت.
   2. قم بقياس تفاعل سطح IE عن طريق قياس التدفق الخلوي. عادة ما يؤدي الاختيار الناجح للأجسام المضادة إلى مجموعة طفيليات تعبر عن VAR2CSA في معظم الطفيليات (≈80٪).
5. بالنسبة لمقايسة البلعمة ، استخدم تروفوزويت IEs المنقى في المرحلة المتوسطة إلى المتأخرة. قم بإجراء التنقية باستخدام الفصل المغناطيسي كما هو موضح سابقا.
   ملاحظه: لتحديد مرحلة الطفيليات بدقة ، قم بإجراء تلطيخ Giemsa على مسحات الدم متبوعا بمراقبة المجهر الضوئي. اتبع الإجراءات القياسية والإرشادات المورفولوجية كما هو موضح سابقا. يمكن أيضا إجراء تنقية المرحلة المتأخرة باستخدام وسط تدرج الكثافة. ومع ذلك ، فإن عائد IE في تجربتنا أقل ، وبالتالي ، يفضل التنقية المغناطيسية.
   1. للفصل المغناطيسي ، قم بتدوير مزرعة الطفيليات (5-10٪ طفيليات الدم) عند 500 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من وسط زراعة الطفيليات.
   2. أضف تعليق الطفيلي إلى سيليكا فلاش كلاريسيب ، عمود CS مقترنا بمغناطيس (انظر جدول المواد) واتركه يمر ببطء عبر العمود. Trophozoite-IEs هي مغناطيسية (بسبب وجود الهيموزوين) وستبقى في شبكة العمود.
   3. اغسل العمود ب 50 مل من وسط زراعة الطفيليات وقم بإزالة IEs من العمود المغناطيسي باستخدام 50 مل من وسط زراعة الطفيليات.
6. قم بتدوير المصفاة من 1.5.3 عند 500 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية بعناية وأعد تعليقها في 1 مل من وسط زراعة الطفيليات.
7. باستخدام مقياس كثافة الدم ، احسب عدد IEs (التي يمكن تحديدها بسهولة عن طريق المجهر الضوئي على أنها كريات الدم الحمراء ذات صبغة الهيموزوين الداكنة) والعدد الكلي للخلية لحساب الطفيليات النهائية (النسبة المئوية ل IEs).
   ملاحظه: استخدم فقط الطفيليات ذات النقاء 80٪ على الأقل (80٪ IEs).
8. بناء على عدد عينات المصل / الأجسام المضادة المخطط لها للاختبار ، قم بتقدير الكمية الإجمالية من IEs المطلوبة وتوسيع نطاق مزارع الطفيليات وفقا لذلك. يجب أن تنتج قارورة مزرعة مقاس 75 سم² مع 25 مل من المزرعة بنسبة 5٪ هيماتوكريت و 5-10٪ طفيليات ما يكفي من IEs لتشغيل لوحة كاملة مكونة من 96 بئرا. للحصول على لوحة كاملة (42 عينة بالإضافة إلى 6 عناصر تحكم مكررة) ، هناك حاجة إلى تعليق طفيلي لا يقل عن 1.5 مل عند 3.3 × 10⁷ IEs / مل.

فئة

2. خلايا THP-1

ملاحظة: يتم استخدام خط خلية THP-1 في هذا الفحص. يشتق خط الخلايا الأحادية هذا من مريض مصاب بسرطان الدم أحادي الخلية ويمكن شراؤه من مجموعة ثقافة النوع الأمريكية (ATCC). حافظ على خط الخلية وفقا لتعليمات المزود في وسط ثقافة THP-1 (انظر جدول المواد).

1. للصيانة الدورية ، ابدأ زراعة خلايا THP-1 عند 2-4 × 10⁵ خلايا / مل والزراعة الفرعية عندما يصل تركيز الخلية إلى 8 × 10⁵ خلايا / مل
   ملاحظه: لا تسمح لتركيز الخلية بتجاوز 1 × 10⁶ خلايا / مل وتتبع رقم الممر. تجنب استخدام الخلايا التي تتجاوز مرور 25. يتراوح متوسط وقت مضاعفة خط خلية THP-1 بين 19-50 ساعة. تحديد وقت مضاعفة دفعة الخلية قبل البدء في تجارب البلعمة. سيساعد هذا في تقدير الكمية اللازمة من المزرعة اللازمة لعدد محدد من عينات المصل المراد اختبارها تقريبا (على سبيل المثال ، بالنسبة للوحة 96 بئر كاملة ، هناك حاجة إلى 10 مل من المزرعة عند 5 × 10⁵ خلايا / مل).
2. افحص بشكل دوري خلايا THP-1 للتعبير السطحي عن مستقبلات Fcγ I (CD64) و II (CD32) و III (CD16) كما هو موضح سابقا.
   1. باختصار ، قم بتلطيخ خلايا THP-1 (بشكل منفصل) بالأجسام المضادة المضادة المضادة ل CD64 و anti-CD32 ومضادة ل CD16 (جدول المواد) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (تخفيف 1: 100 محضر في مصل بقري الجنين بنسبة 2٪ (FBS) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
   2. اغسل ثلاث مرات باستخدام 2٪ FBS في PBS وقم بقياس تلطيخ السطح عن طريق قياس التدفق الخلوي. < / > ملاحظه: خلايا THP-1 سلبية ل CD16 وإيجابية ل CD32 و CD64 كما تم الإبلاغ عنه سابقا (الشكل 1).
3. بالنسبة لمقايسة البلعمة ، قم بإعداد قارورة مزرعة خلية THP-1 تحتوي على 2.5 × 10⁵ خلايا / مل في اليوم السابق للتجربة لإنتاج حوالي 5 × 10⁵ خلايا / مل في يوم الفحص. < / > ملاحظه: تأكد من وجود 4-6 × 10⁵ خلايا / مل في يوم الفحص.

< p class = "jove_title" >3. فحص البلعمة (الشكل 2)

1. قبل البدء في الفحص ، قم بحظر (>1 ساعة) لوحين مستديرين القاعين 96 بئر (أحدهما للضلاع والآخر للبلعمة) باستخدام 150 ميكرولتر لكل بئر من FBS المعقم 2٪ في PBS. < / > ملاحظه: قم بتسمية اللوحة 1 كلوحة opsonization واستخدمها في تلطيخ بروميد الإيثيديوم (EtBr) والتظليل. قم بوضع علامة على لوحة الملصقات 2 كلوحة بلعمة واستخدمها لطلاء خلية THP-1 وخطوة البلعمة.
2. تلطيخ الطفيليات والتظليل
   1. خذ معلق IE المحضر في 1.6 واضبط عدد الخلايا على 3.3 × 10⁷ IEs / مل عن طريق إضافة وسط زراعة الطفيليات وبروميد الإيثيديوم (EtBr) لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 2.5 ميكروغرام / مل (تخفيف 1:40 ، من مخزون 0.1 مجم / مل).
      ملاحظه: يلطخ EtBr الحمض النووي للطفيليات ، مما يسمح بالكشف عن طريق قياس التدفق الخلوي.
      أنذر: EtBr هو مطفر ومهيج للجلد والعين والجهاز التنفسي. استخدم الحماية المناسبة وتخلص من النفايات وفقا للوائح المحلية.
   2. قم بإزالة محلول الحظر من أحد ألواح البئر البالغ عددها 96 (لوحة التظليل) ، ونفض الغبار على اللوحة وإزالة السائل الزائد فوق قطعة من ورق المناشف.
   3. أضف 30 ميكرولتر لكل بئر من تعليق IE المحضر أعلاه في النصف العلوي من اللوحة. اترك واحدة فارغة وأضف 30 ميكرولتر من وسط زراعة الطفيليات (بدون IEs للتحكم في THP-1 وحده). (الشكل 3 أ). احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ومحمية من الضوء.
   4. أضف 170 ميكرولتر لكل بئر من وسط زراعة الطفيليات. قم بتدوير اللوحة على حرارة 500 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة وقم بإزالة المادة الطافية عن طريق تحريك اللوحة فوق حاوية نفايات مناسبة.
   5. اغسل IEs التي تحمل علامة EtBr مرتين أخريين باستخدام 200 ميكرولتر لكل بئر من وسط زراعة الطفيليات ، وقم بتدوير اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يمكن إزالة المادة الطافية من الغسيل الأول عن طريق النقر على اللوحة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية من الغسيل الثاني باستخدام ماصة متعددة القنوات للتأكد من إزالة الحجم الكامل لوسط الغسيل. لا تزعج الحبيبات.
   6. أعد تعليق IEs المسمى EtBr في 30 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة/البلازما/المصل المحضر بالتركيزات المطلوبة في وسط زراعة الطفيليات.
   7. قم دائما بتضمين عناصر التحكم التالية (الشكل 3 ب): عنصر تحكم بدون تحكم خلايا IEs / THP-1 (وسط زراعة الطفيليات) ؛ تحكم بدون أي جسم مضاد أو بلازما / مصل (تحكم غير مضاد) ؛ تحكم إيجابي باستخدام الجسم المضاد للأرانب المضاد لكريات الدم الحمراء البشرية المتاح تجاريا عند تخفيف 1: 100 (انظر جدول المواد); اثنين من عناصر التحكم السلبية في البلازما/المصل عند التخفيف 1:5 (بركة ساذجة للملاريا وبركة من الذكور المعرضين للملاريا)؛ وتحكم إيجابي في المصل عند تخفيف 1: 5 (تجمع من النساء المعرضات للملاريا ، اللواتي كن حوامل سابقا (يفضل متعدد الحملات)).
      ملاحظه: يبدو أن التخفيف بنسبة 1: 100 للتحكم الإيجابي يعمل باستمرار عبر دفعات مختلفة من الأجسام المضادة المشتراة (البيانات غير معروضة). ومع ذلك ، يوصى باستبعاد الاختلافات بين الدفعات عن طريق اختبار عدة تخفيفات في كل مرة يتم فيها استخدام دفعة جديدة من الأجسام المضادة.
   8. احتضن لمدة 45 دقيقة في الظلام عند 37 درجة مئوية.
3. تحضير خلايا THP-1 والبلعمة
   1. أثناء إجراء مضادة ل IEs (3.2.8) ، ابدأ في تحضير خلايا THP-1.
   2. قم بإزالة خلايا THP-1 من قارورة الثقافة ، وقم بتدويرها لأسفل (500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة) ، وصب المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط زراعة الخلية THP-1.
   3. تدور مرة أخرى (500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة) ، وصب المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط زراعة الخلايا THP-1.
   4. حدد عدد الخلايا في المحلول المحضر أعلاه وأضف المزيد من الوسط للحصول على تركيز نهائي يبلغ 5 × 10⁵ خلايا / مل.
   5. قم بإزالة محلول الانسداد من اللوحة المتبقية التي تحتوي على 96 بئرا (لوحة البلعمة) عن طريق النقر فوق اللوحة وإزالة السائل الزائد فوق قطعة من ورق المناشف.
   6. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من معلق الخلية THP-1 المحضر في 3.3.4 وأعده إلى حاضنة زراعة الخلايا (الشكل 3 ج).
   7. بمجرد انتهاء وقت حضانة الجسم المضاد / البلازما / المصل ، أضف 170 ميكرولتر لكل بئر من وسط زراعة الطفيليات. قم بتدوير اللوحة على حرارة 500 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة وقم بإزالة المادة الطافية عن طريق تحريك اللوحة فوق حاوية نفايات مناسبة.
   8. اغسل IEs المرجعية مرتين أخريين باستخدام 200 ميكرولتر لكل بئر من وسط زراعة الطفيليات ، وقم بتدوير اللوحة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يمكن إزالة المادة الطافية من الغسيل الأول عن طريق النقر على اللوحة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية من الغسيل الثاني ، باستخدام ماصة متعددة القنوات للتأكد من إزالة الحجم الكامل لوسط الغسيل. لا تزعج الحبيبات.
   9. أخيرا ، أعد تعليق IEs المضادة للذكاء في 100 ميكرولتر من وسط زراعة خلايا THP-1 الدافئ مسبقا. انقل 50 ميكرولتر من معلق IE المنحني إلى كل بئر في لوحة البلعمة. نظرا لوجود إجمالي 100 ميكرولتر من IEs ، يمكن تشغيل كل تخفيف للجسم المضاد / المصل في نسخ مكررة في لوحة البلعمة (الشكل 3 د)
      ملاحظه: تتوافق كمية خلايا IEs و THP-1 المستخدمة في الفحص مع نسبة 10: 1.
   10. احتضن لمدة 40 دقيقة في الظلام عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂).
       ملاحظه: لا تسمح للبلعمة بالمضي قدما لأكثر من 40 دقيقة.
   11. أوقف البلعمة عن طريق الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية (500 × جم ، 5 دقائق) وتخلص من المادة الطافية عن طريق النقر على اللوحة. أضف 150 ميكرولتر من محلول تحلل كلوريد الأمونيوم بدرجة حرارة الغرفة (جدول المواد) واخلطه عن طريق سحب العينات ، واحتضنه لمدة 3 دقائق بالضبط < br / > ملاحظه: ستعمل هذه الخطوة على تحلل كريات الدم الحمراء التي لم يتم البلعمة بواسطة خلايا THP-1.
   12. أوقف التحلل بإضافة 100 ميكرولتر من FBS المثلج البارد 2٪ في PBS. قم بتدوير اللوحة عند 4 درجات مئوية (500 × جم لمدة 3 دقائق) وقم بإزالة المادة الطافية عن طريق تحريك اللوحة فوق حاوية نفايات مناسبة.
   13. اغسل ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر لكل بئر من المثلج البارد 2٪ FBS في PBS ، وقم بتدوير اللوحة عند 4 درجات مئوية (500 × جم لمدة 3 دقائق). بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق 200 ميكرولتر من FBS المثلج البارد 2٪ في PBS وعلى الفور ، قم بتحليله عن طريق قياس التدفق الخلوي.
       ملاحظه: استخدمت المنشورات السابقة تثبيت الخلية في 2٪ بارافورمالدهيد قبل قياس التدفق^{الخلوي 31} ، ولكن تم الحصول على النتائج المعروضة هنا فور اكتمال الفحص. لا ينصح بتأجيل الحصول على بيانات قياس التدفق الخلوي عن طريق تخزين اللوحة عند 4 درجات مئوية ، نظرا لأن النسبة المئوية لخلايا EtBr ⁺ THP-1 تتحلل بسرعة (الشكل 4).

< p class = "jove_title" >4. اكتساب وتحليل قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: يمكن استخدام أي مقياس تدفق خلوي يدعم تنسيق لوحة 96 بئرا ويحتوي على الليزر / المرشحات المناسبة لقياس مضان EtBr.

1. للاقتناء ، قم بإنشاء بوابة على خلايا THP-1 باستخدام مخطط التشتت الخطي الأمامي (FSC) مقابل مخطط التشتت الجانبي الخطي (SSC) باستخدام الآبار التي لم تتم فيها إضافة IEs (الشكل 2 أ) واكتساب 10,000 حدث على هذه البوابة.
2. قم بقياس شدة التألق ل EtBr (FL3-Log) على بوابة THP-1 باستخدام مخطط الرسم البياني.
3. بالنسبة للبوابات ، البوابة الأولى على خلايا THP-1 في مخطط كثافة FSC مقابل SSC ، باستخدام الآبار التي لم تتم إضافة IEs فيها (الشكل 5 أ). ثم قم بإعداد بوابة موجبة في الرسم البياني FL3 (EtBr) ، باستخدام خلايا THP-1 (لم تتم إضافة IEs) والتحكم غير المؤكسي (الشكل 5 ب).
4. انسخ هذه البوابات في جميع العينات الأخرى التي تم اختبارها في نفس اللوحة وحدد النسبة المئوية لخلايا THP-1 الإيجابية ل EtBr (خلايا THP-1 التي تعرضت للبلعمة IE واحدة على الأقل). لكل عينة من العينات التي تم اختبارها ، يمكن الإبلاغ عن البلعمة على أنها القيم المطلقة (النسبة المئوية لخلايا EtBr ⁺ THP-1) أو كبلعمة نسبية محسوبة كنسبة مئوية باستخدام التحكم الإيجابي كحد أقصى.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: مستقبلات Fc المعبر عنها على سطح خلية THP-1. (أ) مستقبلات Fcγ III / CD16 (أحمر). (ب) مستقبلات Fcγ II / CD32 (أخضر). C. مستقبلات Fcγ I / CD64 (برتقالي). تظهر الخلايا غير المسماة باللون الأزرق.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2: مخطط تدفق مقايسة البلعمة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 96 لوحة لزراعة خلايا البئر ، قاع دائري مع غطاء كورنينج 3799 يمكن استخدام أي لوحة مماثلة ، تأكد من أنها متوافقة مع أداة مقياس التدفق الخلوي التي تنوي استخدامها البوماكس الثاني جيبكو 11021-037 AlbuMAX-II (5٪) - - 5٪ AlbuMAX-II (Gibco ، 11021-037) ، 0.2 جم / لتر هيبوكسانثين (سيجما ، H9377) في RPMI1640 (سيجما ، R5886) الأجسام المضادة لخلايا الدم الحمراء أبكام أب34858 قم بإعداد الحصص وتجميد -20 درجة مئوية. استخدم حصة واحدة لكل تجربة. DPBS سيغما ص 8622 Dynabeads بروتين G إنفيتروجين 10003 د محلول بروميد الإيثيديوم سيغما E1510 قم بإعداد محلول مخزون عند 0.1 مجم / مل في RPMI1640 (R5886). تخزين محمي من الضوء مقياس التدفق الخلوي FC500 بيكمان كولتر يمكن استخدام أي مقياس تدفق خلوي يدعم تنسيق لوحة 96 جيدا ويحتوي على الليزر / المرشحات المناسبة لقياس مضان EtBr. مصل الأبقار الجنينية (FBS) جيبكو 10099-141 قم بتعطيل الحرارة قبل الاستخدام. فأر FITC مضاد للإنسان CD16 BD Biosciences 555406 أو 556618 فأر FITC مضاد للإنسان CD32 BD Biosciences 552883 ماوس FITC مضاد للإنسان CD64 BD Biosciences 555527 برنامج FlowLogic تقنيات إنيفاي يمكن استخدام أي تحليل لقياس التدفق الخلوي ، على سبيل المثال FlowJo أو Winlist جنتاميسين (10 مجم / مل) سيغما جي 1272 هيبوكسانثين سيغما H9377 L-جلوتامين (200 ملم) سيغما جي 7513 محلول التحليل - - 15 ملي مولار NH4Cl ، 10 ملي NaHCO3 ، 1 ملي EDTA عمود MACS CS وملحقاته ميلتيني بيوتيك 130-041-305 وسط استزراع الطفيليات - - 2 ملي مولار L-glutamine (سيجما ، G7513) ، 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين (سيجما ، G1272) ، 0.5٪ AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5٪) في RPMI1640 (سيجما ، R5886) البنسلين / الستربتومايسين (10000U و 10 مجم / مل) سيغما P0781 RPMI-1640 متوسط سيغما R5886 وسط ثقافة THP-1 - - 10٪ FBS (Gibco ، 10099-141) ، 2 ملي ل-جلوتامين (سيجما ، G7513) ، 100U / مل بنسلين ، 0.1 مجم / مل ستربتومايسين (سيجما ، P0781) في RPMI1640 (سيجما ، R5886) مغناطيس Vario MACS ميلتيني بيوتيك