ملاحظة: تصف البروتوكولات التالية تحضير العينة والقياس الكمي لنشاط البروتياز سيرين العدلات (NSPs). تركز الإجراءات التجريبية المعروضة هنا على قياس نشاط البلغم البشري والإيلاستاز العدلات (NE) أو الكاثيبسين G (CG). ومع ذلك ، فإن التعديلات الطفيفة في بروتوكول تحضير العينة تجعل تحليل الخلايا المشتقة من الدم ومجانسات الورم ممكنا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التحقيق في أنشطة المصفوفة للبروتين المعدني والكاتيبسين S بالمثل عن طريق مجسات FRET المخصصة
< p class = "jove_title" >
1. تحضير العينة: عزل الخلايا وفصل المواد الطافية
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: إذا أمكن ، يجب أن يتم علاج البلغم في غضون 120 دقيقة بعد البلغم ويجب تخزين البلغم على الجليد حتى مزيد من المعالجة.
- إذا لم يكن البلغم التلقائي ممكنا ، فقم بتحفيز البلغم كما هو موضح سابقا. باختصار ، استنشق 200 ميكروغرام من السالبوتامول المضاد للمستقبلات β-2 قبل البدء في إجراء تحريض البلغم. بعد ذلك ، استنشق محلول ملحي مفرط التوتر (6٪) لمدة 15 دقيقة باستخدام البخاخات. اجمع البلغم المقشع في طبق بتري.
- افصل الكتل المخاطية عن اللعاب في طبق بتري بمساعدة طرف الماصة.
- وزن المخاط.
ملاحظه: متوسط وزن عينة المخاط هو 0.8 غرام (يتراوح بين 0.1 غرام و 5 جم); عادة ما يكون 0.1 جم كافيا لتنفيذ الإجراءات المذكورة.
- أضف 4 أجزاء (حجم / وزن) من 10٪ سبوتوليسين (في PBS) إلى البلغم (على سبيل المثال ، 4 مل من 10٪ سبوتوليسين لكل جرام من البلغم).
أنذر: يتكون سبوتولليسين من ديثيوثريتول المركز في مخزن الفوسفات ، وبالتالي التعامل معه بحذر.
- احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة (RT) على شاكر هزاز لمدة 15 دقيقة لإذابة المخاط. لأسباب تتعلق بالسلامة ، ضع الخلاط في غطاء الدخان.
- قم بإخماد التفاعل بإضافة نفس الحجم من PBS البارد (على سبيل المثال: 1 مل من PBS البارد لكل مل من 10٪ سبوتولسين).
- امزج عن طريق سحب العينات للحصول على محلول متجانس.
- قم بتصفية الخليط من خلال مصفاة خلية نايلون 100 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل.
- كرر خطوة الترشيح من خلال مصفاة خلايا نايلون 40 ميكرومتر.
- جهاز الطرد المركزي المحلول لمدة 10 دقائق عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية.
- انقل الجزء الطافي بعناية إلى أنبوب جديد واحفظه على الثلج.
ملاحظه: يمكن تخزين الكسور الطافية عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.
- أعد تعليق حبيبات الخلية برفق في 500 ميكرولتر من PBS البارد وضعها على الثلج.
ملاحظه: يجب معالجة جزء الخلية على الفور.
فئة
2. قياس نشاط البروتياز سيرين العدلات
ملاحظة: هنا ، يتم تقديم طرق مختلفة لتحديد نشاط NSP عن طريق مبلغي FRET. يتم تحديد اختيار التكنولوجيا من خلال السؤال الطبي الحيوي المحدد والغرض من التجربة. تم اختبار المجسات المقدمة على نطاق واسع للتأكد من نوعيتها مقابل مجموعة من الإنزيمات ذات الصلة بالرئة. على الرغم من أن المجسات محددة نحو الإنزيم المستهدف ، إلا أن تحقق دائما من خصوصية المسبار في العينة السريرية ذات الاهتمام. يمكن تحقيق ذلك عن طريق احتضان العينة بمثبط إنزيم بروتيني محدد قبل إضافة المسبار ، والذي يجب أن يلغي أي زيادة في نسبة المتبرع / المستقبل (D / A).
- القياس الكمي لنشاط NSP القابل للذوبان عن طريق مقياس الفلور أو مقايسة قارئ اللوحة
ملاحظه: يمكن الكشف عن نشاط البروتياز في الأجزاء القابلة للذوبان من العينة باستخدام أي أداة قادرة على اكتشاف التألق.
- قم بإذابة الإنزيمات على الجليد.
- حتى الاستخدام ، احتفظ ب NE و CG في مخزن تخزين حمضي (50 ملي أسيتات الصوديوم ، 200 ملي كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 5.5) لمنع الانقسام الذاتي.
- لإعداد منحنى قياسي للإنزيم ، قم بإعداد تخفيف تسلسلي 1: 2 للإنزيم (33.9 - 0.271 نانومتر ل NE ؛ 42.6 - 0.333 نانومتر ل CG) في المخزن المؤقت للتنشيط (10 ملي مولار Tris-HCl ، 500 ملي كلوريد الصوديوم عند الرقم الهيدروجيني 7.5). يحتوي المخزن المؤقت للتنشيط على درجة حموضة محايدة وبالتالي يمكن التحفيز الأنزيمي من الحدوث بكفاءة.
- لتحضير أعلى تركيز قياسي (تركيز NE: 33.9 نانومتر) ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من NE (33.9 ميكرومتر) في 999 ميكرولتر من مخزن التنشيط.
- لتحضير المعيار الثاني (تركيز NE: 16.95 نانومتر) ، امزج 200 ميكرولتر من التخفيف الأول مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتنشيط.
- تابع وفقا لذلك لإعداد التخفيفات المتبقية 1: 2.
- يتكون المعيار الأخير ، وهو الفراغ ، من مخزن مؤقت للتنشيط النقي. يوصى بقياس التكرارات الفنية أو النسخ الثلاثية. أثناء التحضير القياسي والعينة ، حاول إبقاء القوارير على الثلج.
- بالتوازي مع المستحضر القياسي ، قم بتخفيف عينات البلغم في مخزن مؤقت للتنشيط. تمييع العينات البشرية قبل تقييم نشاط البروتياز لتبقى في النطاق الخطي لزيادة إشارة المراسل (نسبة D / A). إذا تركت عينات المريض غير مخففة ، فسيحدث الانقسام بسرعة كبيرة جدا بحيث لا يمكن التركيب الموثوق به. نظرا لأن بلغم المتبرع السليم يحتوي على عدد أقل من البروتياز النشط مقارنة بعينات من مرضى التليف الكيسي (CF) ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) ، يتم إجراء تخفيفات مختلفة بشكل عام (1:10 للطاف الصحي للبلغم ، 1: 20-500 للطافي البلغمي لمرضى الانسداد الرئوي المزمن أو التليف الكيسي).
ملاحظه: من أجل قياس نشاط البروتياز كميا في العينات التي يكون تركيزها غير معروف ، يجب قياس منحنى قياسي بتركيزات إنزيم معروفة بالتوازي ، من الناحية المثالية على نفس اللوحة. يتم حساب تركيز الإنزيم النشط في البلغم البشري عن طريق استيفاء المنحدرات المقاسة في عينات البلغم البشري مع تلك المقاسة بالمنحنيات القياسية.
- قبل تحضير العينات للقياس ، قم بإعداد الأداة. اضبط الطول الموجي للإثارة لمسبار NE Förster القائم على نقل الطاقة بالرنين (FRET) (NEmo-1) على 354 نانومتر ، واضبط الطول الموجي للكشف على 400 نانومتر للمتبرع و 490 نانومتر للمتقبل. اضبط الطول الموجي للإثارة لمسبار CG FRET (sSAM) على 405 نانومتر ، واضبط الانبعاث على 485 (مانح) و 580 نانومتر (متقبل).
- أضف 40 ميكرولتر من العينات ، القياسية أو الفارغة في آبار صفيحة نصف مساحة سوداء مكونة من 96 بئر.
- لتحضير المزيج الرئيسي الذي يحتوي على المراسلين (تركيز المراسل في المزيج الرئيسي: 10 ميكرومتر) ، قم بتخفيف مخزون المسبار (1 ملي مولار في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، DMSO) 1: 100 في مخزن التنشيط. قم بإعداد حجم الخلطة الرئيسية المطلوب بضرب 10 ميكرولتر × عدد آبار الصفائح المطلوبة. للوصول إلى التركيز النهائي الأمثل (2 ميكرومتر) لقياس التألق لمراسلي NEmo-1 و sSAM ، أضف 10 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل بئر (يحتوي على 40 ميكرولتر من العينة ، القياسية أو الفارغة) وابدأ القراءة. لذلك سيراقب مراسلو NEmo-1 و sSAM نشاط الإيلاستاز العدلي القابل للذوبان والكاتيبسين G ، على التوالي.
ملاحظه: إذا لم يكن حاقن الكاشف متاحا، فتأكد من بدء القراءة في أقرب وقت ممكن بعد إضافة المبلغ إلى العينات.
- ابدأ قياس قارئ اللوحة وسجل زيادة نسبة D / A كل 60-90 ثانية لمدة 20 دقيقة على الأقل أو حتى تصل الزيادة في الإشارة إلى هضبة.
- بمجرد تصدير البيانات ، احسب نسبة D / A بقسمة وحدات التألق النسبية المانحة (RFU) مع RFU المستقبل لكل نقطة زمنية وعينة.
- احسب متوسط نسبة D / A والانحراف المعياري لكل عينة.
- حدد المنحدر ضمن النمو الخطي لتغير نسبة D / A. المنحدر هو مؤشر على معدل انقسام الإنزيم لمسبار FRET. احسب تركيز الإنزيم النشط في البلغم عن طريق تركيب منحدرات الانحدار الخطي المشتقة من العينات البشرية مع تلك المحسوبة من معيار الإنزيم.
