$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير جهاز الموائع الدقيقة.
- تحضير فحص هجرة الخلايا الدقيقة
- تحضير محلول فيبرونيكتين 50 ميكروغرام / مل عن طريق تخفيف 50 ميكرولتر من محلول الفيبرونيكتين (1 مجم / مل) إلى 950 ميكرولتر من محلول دولبيكو المخزن بالفوسفات (DPBS) داخل خزانة السلامة الحيوية.
- تحضير وسط الهجرة عن طريق خلط 9 مل من وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI-1640) و 1 مل من RPMI-1640 مع 4٪ ألبومين مصل بقري (BSA).
- قم بإزالة الماء منزوع الأيونات من الجهاز.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول الفيبرونيكتين إلى الجهاز من المخرج. انتظر 3 دقائق للتأكد من أن جميع القنوات مملوءة بمحلول الفيبرونيكتين. ضع جهاز الموائع الدقيقة في طبق بتري مغطى لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة محلول الفبرونيكتين من الجهاز. أضف 100 ميكرولتر وسط ترحيل من المخرج. انتظر 3 دقائق للتأكد من أن جميع القنوات مملوءة بوسيط الترحيل.
- احتضان الجهاز لمدة ساعة أخرى في درجة حرارة الغرفة ؛ ثم يكون الجهاز جاهزا لتجربة الانجذاب الكيميائي.
- تحضير محلول الجاذب الكيميائي لتجربة الانجذاب الكيميائي.
- قم بإعداد محلول fMLP 100 نانومتر في وسط ترحيل إجمالي 1 مل. امزج 5 ميكرولتر من المخزون FITC-Dexterrn (10 كيلو دالتون ، 1 مل) مع محلول fMLP في أنبوب سعة 1.5 مل.
ملاحظه: يستخدم FITC-Dextran لقياس التدرج. بدلا من ذلك ، استخدم الرودامين كمؤشر متدرج. ثم يكون محلول الجاذب الكيميائي fMLP جاهزا لتجربة الانجذاب الكيميائي.
- تحضير عينة البلغم.< / >
ملاحظه: تم اختبار الانجذاب الكيميائي للعدلات الناجم عن تدرج عينات البلغم من مرضى الانسداد الرئوي المزمن كتطبيق تشخيصي سريري لهذه الطريقة الشاملة.
- الحصول على بروتوكول أخلاقيات الإنسان لجمع عينات البلغم من مرضى الانسداد الرئوي المزمن.
ملاحظه: حصلنا على موافقات لجمع العينات في مستشفى Seven Oaks العام في وينيبيغ (المعتمد من جامعة مانيتوبا).
- الحصول على نماذج الموافقة الخطية المستنيرة من جميع المواد.
- جمع عينات البلغم التلقائي لمرضى الانسداد الرئوي المزمن. ضع عينة بلغم سعة 500 ميكرولتر في أنبوب سعة 1.5 مل.
- أضف 500 ميكرولتر 0.1٪ ديثيوثريتول في أنبوب 1.5 مل واخلطه برفق. ضع الأنبوب في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- قم بالطرد المركزي للعينة عند 753 × جم لمدة 10 دقائق ثم اجمع المادة الطافية. جهاز الطرد المركزي للطافي عند 865 × جم لمدة 5 دقائق ثم اجمع المادة الطافية النهائية. قم بتخزين المادة الطافية التي تم جمعها داخل فريزر -80 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- عندما تكون جاهزا لتجربة الانجذاب الكيميائي ، قم بإذابة محلول البلغم ؛ انقل وسط ترحيل 900 ميكرولتر إلى أنبوب 1.5 مل واخلطه مع محلول بلغم 100 ميكرولتر داخل خزانة السلامة الحيوية ؛ ثم يكون محلول البلغم جاهزا لتجربة الانجذاب الكيميائي.
- جمع عينات الدم.
- الحصول على بروتوكول أخلاقيات الإنسان لجمع عينات الدم من المتبرعين الأصحاء. الحصول على استمارات الموافقة الخطية المستنيرة من جميع المتبرعين بالدم.
ملاحظه: هنا تم الحصول على عينات في مستشفى فيكتوريا العام في وينيبيغ (تمت الموافقة عليها من قبل مجلس أخلاقيات البحث المشترك في جامعة مانيتوبا).
- اجمع عينة الدم عن طريق بزل الوريد وضع العينة في أنبوب مغطى ب EDTA. احتفظ بالأنبوب في خزانة السلامة الحيوية قبل التجربة.
2. عملية فحص الانجذاب الكيميائي الكل على الرقاقة
- عزل الخلايا على الرقاقة (الشكل 1 ب).
- ضع 10 ميكرولتر من الدم الكامل في أنبوب سعة 1.5 مل داخل خزانة السلامة الحيوية.
ملاحظه: تفاصيل جمع عينات الدم موجودة في القسم 1.4.
- أضف 2 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة (Ab) و 2 ميكرولتر من الجسيمات المغناطيسية (MP) من مجموعة عزل العدلات (انظر جدول المواد) في أنبوب 1.5 مل واخلطه برفق ؛ سيؤدي ذلك إلى تسمية الخلايا في الدم باستثناء العدلات.
- احتضان خليط الدم Ab-MP لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظه: سيؤدي ذلك إلى وضع علامة مغناطيسية على الخلايا المسماة بالأجسام المضادة في الدم.
- قم بتوصيل قرصين مغناطيسيين صغيرين على جانبي منفذ تحميل الخلية بالجهاز. استنشق الوسيط من جميع منافذ الجهاز.
- ماصة ببطء 2 ميكرولتر من خليط الدم-Ab-MP في جهاز الموائع الدقيقة من منفذ تحميل الخلية.
ملاحظة: يتم احتجاز الخلايا المصنفة مغناطيسيا على الجدران الجانبية لمنفذ تحميل الخلية بينما تتدفق العدلات إلى الجهاز وتصبح محاصرة في هيكل إرساء الخلية.
- انتظر بضع دقائق حتى يتم احتجاز عدد كاف من العدلات في منطقة إرساء الخلية.
< p class = "jove_title" >
3. مقايسة الانجذاب الكيميائي (الشكل 1 ج).
- ضع جهاز الموائع الدقيقة على مرحلة المجهر الذي يتم التحكم في درجة حرارته عند 37 درجة مئوية.
- أضف 100 ميكرولتر محلول جاذب كيميائي (fMLP أو محلول بلغم) ووسط ترحيل 100 ميكرولتر إلى خزانات المدخل المخصصة لها باستخدام ماصات؛ سيؤدي ذلك إلى توليد تدرج جاذب كيميائي في قناة التدرج عن طريق الخلط الكيميائي المستمر القائم على التدفق الرقائقي بمساعدة هيكل موازنة ><الضغط.
ملاحظه: تفاصيل جمع البلغم من مرضى الانسداد الرئوي المزمن موجودة في القسم 1.3.
- بالنسبة لتجربة التحكم في المتوسط ، أضف وسط الهجرة فقط إلى كل من خزانات المدخل.
- احصل على صورة مضان FITC-Dextran في قناة التدرج.
- قم باستيراد الصورة إلى برنامج ImageJ باستخدام الأمر "File|مفتوح".
- قم بقياس ملف تعريف شدة التألق عبر قناة التدرج باستخدام الأمر "تحليل |ملف الحبكة".
- تصدير بيانات القياس إلى جدول بيانات لمزيد من التخطيط.
- احتضان الجهاز في مرحلة المجهر الذي يتم التحكم في درجة حرارته أو في حاضنة زراعة الخلايا التقليدية لمدة 15 دقيقة.
- قم بتصوير قناة التدرج باستخدام هدف 10X لتسجيل المواضع النهائية للخلايا لتحليل البيانات.
- إذا لزم الأمر، قم بتسجيل ترحيل الخلية في الجهاز عن طريق الفحص المجهري بفاصل زمني.
4. تحليل بيانات ترحيل الخلايا (الشكل 1 ج)
- قم بتحليل مقايسة الانجذاب الكيميائي عن طريق حساب مسافة ترحيل الخلية من بنية الإرساء كما هو موضح أدناه. انظر الشكل 1 ج.
- قم باستيراد الصورة إلى برنامج NIH ImageJ (الإصدار 1.45).
- حدد مركز كل خلية انتقلت إلى قناة التدرج.
- قم بقياس إحداثيات الخلايا المحددة لمواقعها النهائية. قم بقياس إحداثيات نقطة عند حافة هيكل الإرساء كموضع مرجعي أولي.
- تصدير بيانات الإحداثيات المقاسة إلى برنامج جداول البيانات (مثل Excel). احسب مسافة ترحيل الخلايا كفرق بين الموضع النهائي للخلية والموضع المرجعي الأولي على طول اتجاه التدرج.
- معايرة المسافة إلى ميكرومتر. احسب متوسط وانحراف مسافة الهجرة لجميع الخلايا كمقياس للانجذاب الكيميائي.
- قارن مسافة الهجرة في وجود تدرج جاذب كيميائي بتجربة التحكم الوسيط باستخدام اختبار t الخاص بالطالب.
- إذا تم تسجيل صور الفاصل الزمني لهجرة الخلية ، فيمكن تحليل هجرة الخلايا والانجذاب الكيميائي بشكل أكبر عن طريق تحليل تتبع الخلية.
ملاحظه: المواد المطلوبة لبناء وإجراء مقايسة الانجذاب الكيميائي الشامل على الرقاقة مفصلة في جدول المواد.
