اختبار في المختبر لدراسة السمية الخلوية لخلايا CD8 + T المنشطة مسبقا ضد الخلايا السرطانية

الملخص

المصدر: Kitamura، T.، et al. الكشف في الوقت الحقيقي عن موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية في المختبر الناجم عن الخلايا التائية CD8 ⁺ لدراسة الوظائف المثبطة للمناعة للخلايا النخاعية المتسللة للورم. J. Vis. إكسب. (2019)

يعرض هذا الفيديو اختبار موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية التي تسببها الخلايا التائية المستجيبة المنشطة مسبقا. من خلال الزراعة المشتركة لهذه الخلايا مع الخلايا السرطانية المميزة بنوك الفلورسنت ، تتم إضافة ركيزة فلورية قابلة للانقسام في الكاسباز. ستعرض الخلايا السرطانية موت الخلايا المبرمج لونا مختلفا في نواتها ، مما يؤدي إلى تألق مزدوج. يدل هذا التألق المزدوج على خضوع الخلايا السرطانية لموت الخلايا المبرمج.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الخلايا المستهدفة التي تعبر عن البروتين الفلوري الأحمر في نواتها

1. احصل على خط خلايا سرطان الفأر المستهدف من مصدر مناسب.
   ملاحظه: في هذا البروتوكول ، يتم استخدام مشتق شديد النقائل من الخلايا السرطانية الثديية للفأر E0771 (E0771-LG). تنشأ خلايا E0771 الأبوية من الفئران C57BL / 6.
2. قم بإذابة وصيانة قارورة من خلايا E0771-LG باستخدام Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) بما في ذلك 10٪ (v / v) مصل الأبقار الجنينية (FBS) في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، و 95٪ رطوبة ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   ملاحظه: يجب التأكد من أن الخلايا سلبية للميكوبلازما. تحقيقا لهذه الغاية ، قم بزراعة خلايا E0771 (أو الخلايا المراد اختبارها) لمدة 2-3 أيام كما هو موضح أعلاه (في حالة عدم وجود مضادات حيوية ومضادات الفطريات) ، وجمع 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع. قم بالطرد المركزي للوسط عند 12،419 × جم لمدة 60 ثانية للتخلص من بقايا الخلية ونقل المادة الطافية إلى أنابيب جديدة. حدد تلوث الميكوبلازما باستخدام مجموعة اختبار الميكوبلازما المتوفرة تجاريا (راجع جدول المواد) و / أو تفاعل البوليميراز المتسلسل باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
3. قم بزراعة 5 × 10³ خلايا E0771-LG لكل بئر في صفيحة مكونة من 12 بئرا ، وقم بزراعة الخلايا بنسبة 10٪ (حجم / حجم) FBS-DMEM طوال الليل في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، و 95٪ رطوبة ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   ملاحظه: إذا كان معدل تكاثر الخلايا المستهدفة منخفضا (وقت مضاعفة السكان أكبر من 36 ساعة) ، فيمكن زيادة عدد الخلايا إلى 1 × 10⁴.
4. يستعاض عن الوسط ب 1 مل من 10٪ (v/v) FBS-DMEM بما في ذلك 10 ميكروغرام/مل بوليبرين وإضافة 25 ميكرولتر من الجسيمات الفيروسية (1 × 10⁶ TU/mL) التي تشفر بروتين فلوري أحمر مقيد نووي (mKate2، راجع جدول المواد).
5. استزراع الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، ورطوبة 95٪ ، و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
6. استبدل الوسط ب 10٪ (حجم / حجم) FBS-DMEM وزرع الخلايا لمدة 24-48 ساعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 95٪ رطوبة ، و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
7. استبدل الوسط ب 10٪ (حجم / حجم) FBS-DMEM بما في ذلك 1 ميكروغرام / مل بورومايسين عندما تبدأ الخلايا في التعبير عن بروتين فلوري أحمر ، وزرع الخلايا حتى تصبح ملتقى بنسبة 80-90٪.
   ملاحظه: سيكون تركيز بورومايسين مختلفا بين أنواع الخلايا المستهدفة ويجب تحسينه باستخدام الخلايا غير المنقولة.
8. الزراعة الفرعية للخلايا الباقية لمدة 1-3 ممرات مع 10٪ (حجم / حجم) FBS-DMEM بما في ذلك 1 ميكروغرام / مل من بورومايسين ، ومخزون التبريد في نظام تخزين طور بخار النيتروجين السائل حتى الاستخدام.

< p class = "jove_title" >2. عزل الخلايا المثبطة عن الأورام في الفئران

ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم عزل الخلايا المثبطة (أي البلاعم المرتبطة بالورم الخبيث (MAMs) والخلايا المثبطة المشتقة من النخاع الأحادي (M-MDSCs)) من الرئة التي تحتوي على أورام نقيلية أنشأتها خلايا E0771-LG. يجب تحسين ظروف تفكك الأنسجة وفرز الخلايا لعزل الخلايا عن الأنسجة المختلفة.

1. حقن 1 × 10⁶ خلايا سرطانية (E0771-LG) في وريد الذيل للفئران المتزاوية (C57BL / 6) ، الإناث ، البالغة من العمر 7-10 أسابيع.
2. بعد 14 يوما ، اعزل الرئة التي تحتوي على أورام نقيلية وقم بإعداد معلقات أحادية الخلية من الرئتين المنفوختين عن طريق الهضم الأنزيمي كما هو موضح سابقا.
   ملاحظه: في هذا البروتوكول ، يتم حقن أربعة فئران بخلايا سرطانية ويتم الجمع بين رئتيها النقيليتين للحصول على خلايا مثبطة كافية.
3. احتضان معلقات الخلية المفردة بجسم مضاد مضاد للفأر CD16 / CD32 لمدة 30 دقيقة على الجليد ، وملطخ بالأجسام المضادة الفلورية ل CD45 و F4 / 80 و CD11b و Ly6C و Ly6G (راجع جدول المواد) لمدة 30 دقيقة أخرى.
4. اغسل الخلايا الملطخة مرة واحدة باستخدام 1 مل من PBS الذي يحتوي على 2٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقر (BSA) ، وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 500-1000 ميكرولتر من PBS تحتوي على 2٪ (وزن / حجم) BSA.
5. أضف 3 ميكرومتر من DAPI ، وفرز M-MDSCs (DAPI ^- CD45 ⁺ F4 / 80 ⁺ Ly6G ^- CD11b^ارتفاعLy6C) و MAMs (DAPI ^- CD45 ⁺ F4 / 80 ⁺ Ly6G ^- CD11b^ارتفاعLy6C^منخفض) باستخدام فارز الخلايا (الشكل 1).
   ملاحظه: تعتمد عتبة مستوى Ly6C للتمييز بين MAMs (Ly6Clow) و M-MDSCs (Ly6Chigh) على عتبة البلاعم السنخية المقيمة (RMAC). يتم قياس نقاء الخلايا التي تم فرزها عن طريق قياس التدفق الخلوي بنقاء متوقع يزيد عن 90٪.
6. أعد تعليق الخلايا التي تم فرزها ب 400 ميكرولتر من DMEM تحتوي على 20٪ (v/v) FBS ، و 1٪ (v / v) بنسلين / ستربتومايسين ، و 2 ملي مولار L-glutamine ، و 1٪ (v / v) من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 50 نانومتر 2-ميركابتو إيثانول (يسمى ENRICHED-DMEM ، E-DMEM).
7. احسب عدد الخلايا الحية باستخدام طريقة استبعاد Trypan blue واضبطها على 2 × 10⁶ خلايا/مل باستخدام E-DMEM.
8. احتفظ بالخلايا على الجليد حتى الاستخدام.

3. عزل خلايا CD8 ⁺ T من طحال الفئران

1. عزل الطحال من الفأر المتزامن مع خط الخلايا السرطانية المستهدفة (أي الفئران C57BL / 6 في هذا البروتوكول) على النحو التالي:
   1. القتل الرحيم للحيوان عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون₂.
   2. ضع على لوح تشريح نظيف وامسح الجلد بنسبة 70٪ (v / v) من الإيثانول.
   3. قطع جلد البطن باستخدام المقص لكشف الطحال
   4. اعزل الطحال ، الذي يقع في أدنى المعدة ، وضعه في أنبوب يحتوي على 5 مل من PBS المثلج.
2. باستخدام المكبس الداخلي لمحقنة معقمة سعة 5 مل ، قم بطحن الطحال على مصفاة خلية 100 ميكرومتر موضوعة على أنبوب سعة 50 مل.
3. قم بتمرير الخلايا عبر المرشح باستخدام إجمالي 10 مل من PBS.
4. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 337 × جم لمدة 5 دقائق ، وشفط المادة الطافية.
5. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من PBS تحتوي على 2 ملي مولار من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) و 0.5٪ (وزن / حجم) BSA (عازلة قيد التشغيل) وقم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
6. احسب رقم الخلية الحية واضبطه على 1 × 10⁸ خلايا / مل باستخدام المخزن المؤقت قيد التشغيل.
   ملاحظه: احتفظ بكمية صغيرة من الخلايا كعينة ما قبل التخصيب لفحص النقاء.
7. قم بإثراء خلايا CD8 ⁺ T باستخدام مجموعة تحديد سلبية وفرز مغناطيسي (راجع جدول المواد).
   1. انقل 1 × 10⁸ (1 مل) من خلايا الطحال إلى أنبوب دائري القاع من البوليسترين سعة 5 مل.
   2. أضف 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الحيوية ، واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
   3. أضف 125 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المترافق بالستربتافيدين ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   4. أضف 1.325 مل من المخزن المؤقت للتشغيل ، واخلطه برفق عن طريق سحب العينات.
   5. ضع الأنبوب في المغناطيس ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2.5 دقيقة.
   6. التقط المغناطيس ، واسكب تعليق الخلية المخصب في أنبوب جديد.
8. أعد تعليق الخلايا المخصبة ب 200 ميكرولتر من E-DMEM (أي DMEM يحتوي على 20٪ (v / v) FBS ، و 1٪ (v / v) بنسلين / ستربتومايسين ، و 2 ملي مولار L-glutamine ، و 1٪ (v / v) من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 50 نانومتر 2-ميركابتو إيثانول).
9. احسب عدد الخلايا الحية واضبطها على 2 × 10⁶ خلايا / مل باستخدام E-DMEM. احتفظ بالخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ حتى الاستخدام.
   ملاحظه: احتفظ بكمية صغيرة من الخلايا كعينة ما بعد التخصيب لفحص النقاء.
10. حدد نقاء الخلايا التائية CD8 ⁺ عن طريق قياس التدفق الخلوي على النحو التالي:
    1. خذ 1 × 10⁴ خلايا من عينات ما قبل التخصيب (الخطوة 3.6) أو ما بعد التخصيب (الخطوة 3.9) واضبط الحجم الإجمالي لكل منها إلى 100 ميكرولتر باستخدام مخزن مؤقت قيد التشغيل.
    2. احتضان معلقات الخلية المفردة بجسم مضاد مضاد للفأر CD16 / CD32 لمدة 30 دقيقة على الجليد ، وصمة عار بالأجسام المضادة الفلورية ل CD45 و CD3 و CD4 و CD8 (راجع جدول المواد) لمدة 30 دقيقة أخرى.
    3. اغسل الخلايا الملطخة ب 500 ميكرولتر من PBS تحتوي على 2٪ (وزن / حجم) BSA ، وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 500-1000 ميكرولتر من PBS تحتوي على 2٪ (وزن / حجم) BSA.
11. أضف 3 ميكرومتر من 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ، وحدد النسبة المئوية لخلايا CD3 ⁺ CD4-CD8 ⁺ في إجمالي خلايا CD45 ⁺.

4. تنشيط وتوسيع خلايا CD8 ⁺ T المعزولة

1. Aliquot 1 × 10⁵ خلايا لكل 50 ميكرولتر من خلايا CD8 ⁺ T (محضرة في الخطوة 3.9) في آبار صفيحة U-bottom 96 بئر.
2. أضف 1 × 10⁵ خلايا لكل 50 ميكرولتر من الخلايا المثبطة (المحضرة في الخطوة 2.7) أو 50 ميكرولتر من E-DMEM في الآبار.
3. قم بإعداد وسط تنشيط يتكون من E-DMEM ، 4 × 10⁴ U / مل عامل تحفيز المستعمرة 1 (CSF-1) ، 240 U / mL interleukin-2 (IL-2) ، 8 ميكروغرام / مل الجسم المضاد CD3ε المضاد للفأر ، و 16 ميكروغرام / مل الجسم المضاد CD28 المضاد للفأر.
   ملاحظه: CSF-1 غير مطلوب لتنشيط الخلايا التائية ، ولكنه ضروري لبقاء الخلايا المثبطة في هذا البروتوكول (أي MAMs و M-MDSCs). وبالتالي ، يتم الاحتفاظ بها في الزراعة المشتركة للخلايا التائية مع الخلايا السرطانية المستهدفة للحفاظ على الاتساق في ظروف الاستزراع. نظرا لأن السائل الدماغي النخاعي -1 موجود في تركيزات المولار النانوية في جميع الأنسجة وهو مطلوب لصلاحية الخلايا الأحادية / البلاعم في الجسم الحي ، فهذا سياق فسيولوجي لهذه الخلايا.
4. أضف 50 ميكرولتر من وسط التنشيط (الخطوة 4.3) و 50 ميكرولتر من E-DMEM مع أو بدون كواشف ليتم اختبارها.
5. ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، ورطوبة 95٪ ، و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2 ،} وقم بزراعة الخلايا لمدة 4 أيام.

فئة

5. إعداد الزراعة المشتركة للخلايا المستهدفة مع خلايا CD8 ⁺ T المنشطة مسبقا

1. أضف 30 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي القابلة للذوبان المخففة بعامل النمو المخفف 1: 100 (جدول المواد) في آبار الصفيحة المسطحة القاع المكونة من 96 بئرا المناسبة للفحص المجهري ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة ساعة واحدة على الأقل.
2. تحضير الخلايا المستهدفة (على سبيل المثال ، خلايا E0771-LG التي تعبر عن بروتين الفلورسنت الأحمر المقيد نوويا).
   1. احتضان الخلايا المستهدفة ب 1 مل من 0.05٪ تريبسين / EDTA في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة ، وحصاد الخلايا عن طريق سحب العينة اللطيف.
   2. أضف 9 مل من DMEM بما في ذلك 10٪ (حجم / حجم) FBS ، وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 337 × جم لمدة 5 دقائق.
   3. أعد تعليق الخلايا ب 500 ميكرولتر من E-DMEM ، واحسب عدد الخلايا الحية.
      ملاحظه: قبل عد الخلايا المستهدفة ، قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر لإنتاج معلق أحادي الخلية.
   4. اضبط الكثافة على 2 × 10⁴ خلايا / مل (= 1 × 10³ خلايا لكل 50 ميكرولتر) عن طريق إضافة E-DMEM ، واحتفظ بالخلايا على الجليد.
3. تحضير الخلايا المستجيبة (أي خلايا CD8 ⁺ T المنشطة مسبقا).
   1. أعد تعليق الخلايا في بئر من صفيحة 96 بئرا (الخطوة 4.5) جيدا عن طريق سحب العينات ، وانقل خلايا CD8 ⁺ T العائمة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
      ملاحظه: تلتصق MAMs و M-MDSCs بإحكام بالبئر ولا يتم فصلها بواسطة سحب العينات.
   2. لجمع الخلايا المتبقية ، أضف 200 ميكرولتر من PBS إلى البئر وانقله إلى الأنبوب في الخطوة 5.3.1.
   3. اغسل الخلايا ب 1 مل من E-DMEM مرة واحدة (جهاز طرد مركزي عند 337 × جم) لمدة 5 دقائق ، وقم بالشفط والتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليقها ب 100 ميكرولتر من E-DMEM.
   4. احسب عدد الخلايا الحية (باستخدام طريقة استبعاد trypan blue) ، واضبط الكثافة على 1.6 × 105 خلايا / مل (= 4 × 10³ خلايا / 25 ميكرولتر) ، واحتفظ بالخلايا على الجليد.
4. استنشق مصفوفة الغشاء القاعدي من كل بئر من اللوحة في الخطوة 5.1.
5. أضف 1 × 10³ خلايا / 50 ميكرولتر من الخلايا المستهدفة (الخطوة 5.2.4) في كل بئر واخلطها جيدا.
   ملاحظه: لتجنب تأثيرات الحواف بسبب تبخر الوسط ، يجب استخدام 60 بئرا داخلية فقط من لوحة 96 بئرا للتحليل.
6. أضف 25 ميكرولتر من E-DMEM ، بما في ذلك 4 × 10 و³ U / مل IL-2 و 10 ميكرومتر من ركيزة الكاسباز الفلورية -3 (راجع جدول المواد).
7. أضف 4 × 10³ خلايا / 25 ميكرولتر من خلايا CD8 ⁺ T (الخطوة 5.3.4) في الآبار المناسبة واخلطها جيدا.
   ملاحظه: إن وجود عدد كبير جدا من الخلايا في البئر يجعل التحليل أكثر صعوبة. في هذا النموذج ، كانت نسبة المستجيب 4: 1: الهدف (إجمالي عدد الخلية 5 × 10³ خلايا / بئر) هي الأمثل ، لكن نسبة 8: 1 كانت دون المستوى الأمثل. الآبار التي تحتوي على عناصر التحكم الأربعة التالية ضرورية للمساعدة في تحليل البيانات: الخلايا المستهدفة بالكثافة المستخدمة في آبار الزراعة المشتركة (1 × 10³ خلايا / بئر) في وسط مع وبدون ركيزة كاسباز 3 ، خلايا مستجيب (1 × 10³ خلايا / بئر) في وسط مع وبدون ركيزة كاسباز 3.
8. أضف 200 ميكرولتر من PBS أو الماء المعقم في جميع الآبار الفارغة (خاصة الآبار الموجودة على محيط اللوحة) لتقليل تبخر الوسط من الآبار التجريبية.
9. اضبط اللوحة في مجهر مضان بفاصل زمني يتم الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية ، ورطوبة 95٪ ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   ملاحظه: رج اللوحة بنمط متقاطع لتوزيع جميع الخلايا بالتساوي ، ثم اترك اللوحة تبقى في درجة حرارة الغرفة على سطح مستو لمدة 10-20 دقيقة قبل نقلها إلى الحاضنة.

< p class = "jove_title" >6. تصوير الخلايا

ملاحظة: ستختلف إعدادات الحصول على الصور التفصيلية باختلاف المجهر والفلوروفورات المستخدمة ؛ يجب استخدام معلمات الاستحواذ العامة التالية للحصول على أفضل النتائج.

1. باستخدام روتين ضبط تلقائي للصورة مناسب على المجهر ، احصل على صور تغطي ما لا يقل عن 25٪ من إجمالي مساحة السطح في كل بئر تجريبي من اللوحة المكونة من 96 بئرا.
2. اضبط المجهر للحصول على صور في تباين الطور بالإضافة إلى قناة فلورية مناسبة لبروتين الفلورسنت الأحمر المقيد نوويا (mKate2) وقناة فلورية مناسبة لركيزة كاسباز 3 المنشطة بالفلورية الخضراء (مع إثارة عند 488 نانومتر) (الشكل 2).
3. التقط صورا في الآبار التجريبية في تباين الطور وقناتي الفلورسنت كل 1 إلى 3 ساعات لمدة 72 ساعة على الأقل.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. استراتيجية البوابات لعزل الخلايا المثبطة عن الرئة النقيلية. (أ) مخططات نقطية تمثيلية لعزل الخلايا المثبطة المشتقة من النخاع أحادي الخلية (M-MDSCs) والضامة المرتبطة بالورم الخبيث (MAMs). تعتمد عتبة مستوى Ly6C للتمييز بين MAMs (^{Ly6C منخفض}) و M-MDSCs (^{Ly6C عالية}) على عتبة الضامة السنخية المقيمة (RMAC). (ب) نقاء M-MDSCs التي تم ف...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.05٪ تريبسين EDTA (1X) جيبكو هاتف: 25300-054 12-لوحة ثقافة الخلية فرينر بيو ون 665-180 1x برنامج تلفزيوني جيبكو 14190-094 2-ميركابتيثانول سيغما M6250-10 مل 5 مل أنبوب البليسترين المستدير السفلي صقر 352054 لوحة ثقافة الخلايا 96 جيدا (قاع دائري) كوستار 3799 الزراعة المشتركة لخلايا CD8 + T مع الخلايا النخاعية المصنفة صفيحة 96 بئر (قاع مسطح) نونك 165305 الزراعة المشتركة لخلايا CD8 + T مع الخلايا المستهدفة لمقايسة السمية الخلوية AF647 المضاد للفأر F4 / 80 الأجسام المضادة بيو راد MCA497A647 استنساخ: CIA3-1 ، Lot #: 1707 ، 2 ميكرولتر / 1x10 ^ 6 خلايا AlexaFluor700 الأجسام المضادة CD8 المضادة للفأر بيوليجند هاتف: 100730 استنساخ: 53-6.7 ، القطعة #: B205738 ، 0.5 ميكرولتر / 1x10 ^ 6 خلايا الأجسام المضادة CD28 المضادة للفأر بيوليجند 102111 تنشيط خلايا CD8 + T المعزولة ، الاستنساخ: 37.51 ، Lot #: B256340 الأجسام المضادة CD3e المضادة للفأر بيوليجند 100314 تنشيط خلايا CD8 + T المعزولة ، الاستنساخ: 145-2C11 ، Lot #: B233720 APC المضاد للفأر CD3 الأجسام المضادة بيوليجند 100236 استنساخ: 17A2 ، Lot #: B198730 ، 0.5 ميكرولتر / 1x10 ^ 6 خلايا APC / Cy7 الأجسام المضادة Ly6C المضادة للفأر بيوليجند 128026 استنساخ: HK1.4 ، Lot #: B248351 ، 1 ميكرولتر / 1x10 ^ 6 خلايا مصل البقر ألبمين سيغما أ 1470-100 جرام مصفاة الخلية (100 ميكرومتر نايلون) صقر هاتف: 352360 لتحطيم الطحال مصفاة الخلية (40 ميكرومتر نايلون) صقر هاتف: 352340 لتصفية هضم الرئة دابي بيوليجند 422801 Dulbecco ′ النسر المعدل متوسط جيبكو 41966-029 EasySep Mouse CD8 + T T Cell Insulation Kit تقنيات الخلايا الجذعية 19853 مصل الأبقار الجنينية جيبكو 10270-106 FITC المضاد للفأر CD4 الأجسام المضادة بيوليجند 100406 استنساخ: GK1.5 ، Lot #: B179194 ، 0.5 ميكرولتر / 1x10 ^ 6 خلايا Geltrex جاهز للاستخدام جيبكو أ 1596-01 طلاء الألواح المكونة من 96 بئرا لفحص السمية الخلوية كاشف IncuCyte NucLight Red Lentivirus إيسن بيوساينس 4476 الأجزاء الفيروسية العدسية المشفرة mKate2 إنكوسايت زووم إيسن بيوساينس كاشف (مجهر فلوري) إنكوسايت زووم 2018 أ إيسن بيوساينس برنامج التحليل ل-جلوتامين (100X) جيبكو A2916801 طقم تفكك الرئة ميلتيني 130-095-927 تحضير معلق خلية واحدة من الرئة الحاملة للورم طقم الكشف عن الميكوبلازما MycoAlert لونزا LT07-318 الأحماض الأمينية غير الأساسية (100X) جيبكو 11140-035 نوك فيو488 البيوتيوم 10403 الركيزة الفلورية caspase-3 PE المضاد للفأر Ly6G الأجسام المضادة بيوليجند 127607 استنساخ: 1A8 ، Lot #: B258704 ، 0.5 ميكرولتر / 1x10 ^ 6 خلايا PE / Cy7 المضاد للفأر CD11b الأجسام المضادة بيوليجند 101216 استنساخ: M1 / 70 ، Lot #: B249268 ، 0.5 ميكرولتر / 1x10 ^ 6 خلايا القلم Strep جيبكو 15140-122 البنسلين ستربتومايسين للزراعة الأولية للخلايا PerCP / Cy5.5 الأجسام المضادة CD45 المضادة للفأر بيوليجند 103132 استنساخ: 30-F11 ، Lot #: B249564 ، 0.5 ميكرولتر / 1x10 ^ 6 خلايا بوليبرين (سداسيديميثرين بروميد) سيغما H9268 بوروميسين جيبكو أ11138-03 مخزن تحلل كرات الدم الحمراء (10X) بيوليجند 420301 الفئران المؤتلف IL-2 بيبروتك 212-12 تنشيط خلايا CD8 + T المعزولة بيروفات الصوديوم (100X) جيبكو هاتف: 11360-070 الجسم المضاد TruStain fcX (مضاد للفأر CD16 / 32) بيوليجند هاتف: 101320