تقييم تنشيط الكاسباسات المتعددة في البلاعم

الملخص

المصدر: Han، J. et al.، تقييم تنشيط الكاسباز لتقييم موت الخلايا المناعية الفطرية.J. Vis. Exp.(2023)

يوضح هذا الفيديو تقييم تنشيط الكاسباز المتعدد في البلاعم المشتقة من نخاع العظام من خلال التحفيز بفيروس الأنفلونزا. بعد تحلل البلاعم ، والتعطيل الحراري للمحللات ، والطرد المركزي ، يتم جمع الكاسباز داخل الخلايا للتحليل المناعي اللاحق.

البروتوكول

1. إعداد الحلول

1. قم بإعداد الوسائط المكيفة بتقنية L929.
   1. اللوحة 1 × 10⁶ خلايا L929 (انظر جدول المواد) في قارورة زراعة الأنسجة مقاس 182 سم² تحتوي على 50 مل من وسائط زراعة L929 (انظر الجدول 1 لإعداد الوسائط).
   2. قم بزراعة الخلايا في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، ثاني أكسيد الكربون₂.
   3. بعد 7 أيام ، اجمع المادة الطافية ، وقم بالتصفية باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر. تحضير 50 مل من الحصص (قم بتخزين الحصص المجمدة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد).
2. تحضير 500 مل من وسط زراعة البلاعم المشتق من نخاع العظام (BMDM) (الجدول 1).
3. قم بإعداد 500 مل من وسائط تحفيز BMDM (الجدول 1).
4. تحضير 500 مل من الوسائط للعدوى (الجدول 1).
5. تحضير 100 مل من 1 M Tris buffer (الجدول 1).
6. تحضير 4x كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) المخزن المؤقت (الجدول 1).
7. تحضير 1 مل من 1 م 1،4-ديثيوثريتول (DTT ، الجدول 1).
8. تحضير 40 مل من محلول تحلل الكاسباز (الجدول 1).
9. قم بإعداد 100 مل من 1.5 M Tris buffer (الجدول 1).
10. تحضير 100 مل من محلول SDS بنسبة 10٪ (بالوزن / الحجم) (الجدول 1).
11. قم بإعداد 50 مل من المخزن المؤقت لمقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي (RIPA) 2x (الجدول 1).
12. تحضير 5 مجم / مل من محلول عديدات السكاريد الدهنية LPS (الجدول 1).
13. تحضير محلول ثلاثي الفوسفات الأدينوزين 0.5 M (الجدول 1).
14. تحضير محاليل النشاف الغربية.
    1. قم بإعداد 1 لتر من مخزون المخزن المؤقت 5x (الجدول 1).
    2. قم بإعداد 1 لتر من مخزون عازل للنقل 10x (الجدول 1).
    3. تحضير 1 لتر من محلول ملحي مخزن في تريس مع توين 20 (TBST ، الجدول 1).
    4. تحضير 100 مل من محلول حجب الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ (بالوزن / الحجم) (الجدول 1).
15. تحضير محاليل الأجسام المضادة الأولية.
    1. تحضير 10 مل من الجسم المضاد الأولي كاسباز -1 (الجدول 1).
    2. تحضير 10 مل من الجسم المضاد الأولي كاسباز 11 (الجدول 1).
    3. تحضير 10 مل من الجسم المضاد الأولي كاسباز 3 (الجدول 1).
    4. تحضير 10 مل من الجسم المضاد الأولي كاسباز 7 (الجدول 1).
    5. تحضير 10 مل من الجسم المضاد الأولي كاسباز 8 (الجدول 1).
    6. تحضير 10 مل من الجسم المضاد الأولي كاسباز 9 (الجدول 1).
    7. تحضير 10 مل من الجسم المضاد الأولي المترافق ب HRP β-actin (الجدول 1).
16. تحضير محاليل الأجسام المضادة الثانوية.
    1. تحضير 10 مل من الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب (الجدول 1).
    2. تحضير 10 مل من الجسم المضاد الثانوي المضاد للفئران (الجدول 1).
    3. تحضير 10 مل من الجسم المضاد الثانوي المضاد للفئران (الجدول 1).

< p class = "jove_title" >2. عزل الضامة المشتقة من نخاع العظام

ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول ، يمكن استخدام الفئران البرية التي يبلغ عمرها 6-10 أسابيع مع مسارات موت الخلايا المبرمجة السليمة (PCD) أو الفئران الطافرة مع منظمات PCD أو المؤثرات أو الجزيئات ذات الأهمية المحذوفة أو المتغيرة.

1. قتل الفأر في غرفة ثاني أكسيد الكربون₂ بمعدل تدفق يزيح 10٪ -30٪ من حجم القفص في الدقيقة لمدة 2-3 دقائق. بعد ذلك ، قم بإجراء طريقة القتل الرحيم الثانوي ، مثل خلع عنق الرحم. اتبع جميع الإرشادات واللوائح الإضافية الخاصة بالمرافق والمؤسسات والحكومة حيثما ينطبق ذلك.
2. تشريح الفأر لاستعادة عظام الساق الخلفية.
   1. قم بتثبيت الفأر على ظهره حتى يتعرض البطن. رش بنسبة 70٪ (vol / vol) إيثانول لتعقيم الساقين الخلفيتين والبطن.
      أنذر: الإيثانول قابل للاشتعال. احتفظ بها بعيدا عن اللهب المكشوف.
   2. استخدم المقص لعمل شق في خط الوسط للبطن ؛ استمر في القطع باتجاه الساقين لجعل عظم الفخذ مرئيا.
   3. خذ الساق الخلفية اليمنى واسحب الجلد بعيدا عن الجسم باتجاه خط الوسط. فصل الساق عن الجسم عن طريق قطع العضلات المقربة نحو خط الوسط; ثم قطع الساق بين مفصل الورك والعمود الفقري. بعد ذلك ، قم بقطع المخلب بعيدا عن الكاحل ، وقم بإزالة الأنسجة الزائدة من العظم عن طريق تقشير الجلد واستخدام مقص مفتوح قليلا لتجريد أنسجة ربلة الساق.
   4. ضع الساق على منشفة مبللة بالإيثانول بنسبة 70٪ (حجم / حجم) وقم بتشريح الساق وعظم الفخذ.
      1. مشبك الساق وعظم الفخذ مع مجموعة منفصلة من الملقط. اضغط برفق على الظنبوب ضد الاتجاه الطبيعي لمفصل الركبة. سيؤدي ذلك إلى كسر الساق عند الركبة.
      2. استخدم الملقط ومقص التشريح إذا لزم الأمر لإزالة أي مناديل معلقة متبقية. احتفظ بالساق لاستخدامها لاحقا عن طريق وضعها على المنشفة المبللة بالإيثانول.
      3. اجمع عظم الفخذ بنفس الطريقة ، عن طريق قطع الركبة.
   5. كرر الخطوتين 3 و 4 أعلاه للساق اليسرى لإزالتها من الجسم وتشريح الساق وعظم الفخذ.
   6. رش العظام بنسبة 70٪ (حجم / حجم) إيثانول.
   7. نظف العظام عن طريق وضعها على منشفة نظيفة بنسبة 70٪ (حجم / حجم) مبللة بالإيثانول ، والضغط على الجزء اللحمي في المنشفة ، وفرك المنشفة على العظم لإزالة الأنسجة الزائدة.
3. بمجرد أن يصبح كل من عظم الفخذ وكلا الظنبوب نظيفين ، رش العظام الأربعة بنسبة 70٪ (حجم / حجم) الإيثانول. اجمع العظام في طبق بتري معقم واشطفها ب 10 مل من وسائط ثقافة BMDM عن طريق تحريك الوسائط برفق في الطبق.
4. املأ حقنة سعة 10 مل ب 10 مل من وسائط زراعة BMDM الطازجة وقم بإرفاق إبرة 25 جرام.
5. التقط الساق باستخدام الملقط ؛ ثم قم بقطع مفصل الكاحل بزاوية ~ 45 درجة.
6. اغسل نخاع العظم من الساق.
   1. امسك الساق فوق أنبوب سعة 50 مل ، مع توجيه الطرف الضيق من الساق لأسفل. وزع الوسائط على الساق من المحقنة المملوءة.
   2. أدخل الإبرة (برفق في البداية) في الطرف العلوي من النخاع واستغني عن الوسائط.
   3. قم بإزالة الإبرة ثم أدخلها مرة أخرى. استخدم دفعات قصيرة عالية الضغط لتوزيع الوسائط وتحريك الإبرة إلى النخاع.
   4. بمجرد أن تبدأ الوسائط في التدفق من أسفل العظم ، استخدم دفعات قصيرة عالية الضغط لمواصلة طرد الخلايا. راقب لون العظم أثناء هذه العملية ، وعندما يكون العظم أبيض ، تخلص منه.
   5. افعل هذا لكل من الظنبوب.
7. كرر الخطوتين 5 و 6 أعلاه لعظم الفخذ ، مع قطع مفصل الورك حيث تم قطع الساق في مفصل الكاحل. استخدم نفس الأنبوب سعة 50 مل لتجميع وسائط ثقافة BMDM أثناء شطف النخاع.
8. بمجرد مسح جميع العظام الأربعة ، قم بشفط النخاع والوسائط من أنبوب 50 مل لأعلى ولأسفل 3 مرات من خلال إبرة 18 جم على حقنة سعة 10 مل ، واشطف جوانب الأنبوب في كل مرة لتفريق النخاع.
9. اضبط الحجم النهائي في أنبوب 50 مل إلى 30 مل باستخدام وسائط ثقافة BMDM ، وتأكد من تعليق الخلايا تماما.
10. استخدم مصفاة خلية 70 ميكرومتر لتصفية وسائط زراعة BMDM من أنبوب 50 مل.
11. ضع معلق الخلية الناتج ، والذي يحتوي على الخلايا السلفية لنخاع العظم ، في ثلاثة أطباق لزراعة الأنسجة مقاس 150 مم عن طريق إضافة 10 مل (أو ~ 20 × 10⁶ خلايا) لكل منها. بعد ذلك ، أضف 10 مل إضافية من وسائط ثقافة BMDM إلى كل طبق. احتضان في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية.

3. التمييز بين BMDMs والطلاء للتجارب

1. احتضان الخلايا السلفية لنخاع العظم المطلي عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام. ثم قم بإزالة كل طبق ، وأضف 5-8 مل إضافية من وسائط زراعة BMDM (الجدول 1). العودة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
2. في اليوم 5 بعد الطلاء الأولي ، قم بإزالة كل طبق ، وأضف 5 مل إضافية من وسائط استزراع BMDM. العودة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
3. في اليوم 6 ، قم بإزالة كل طبق وتخلص من الوسائط. ثم أضف 10 مل من المحلول الملحي البارد (المخزن عند 4 درجات مئوية) المخزن بالفوسفات (PBS) لغسله مرة واحدة. تخلص من 10 مل من غسل PBS البارد. ثم أضف 10 مل من PBS الطازج والبارد إلى كل طبق ، واحتضن كل طبق على الثلج لمدة 5 دقائق.
4. باستخدام مكشطة خلوية ، اكشط الخلايا برفق من جميع الأطباق الثلاثة في أنبوب واحد سعة 50 مل. قم بتدوير الخلايا برفق عند 270 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ؛ ثم تخلص من الطافف.
5. أضف 20 مل من وسائط زراعة BMDM ، وقم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الحبيبات ، وعد الخلايا. < / > ملاحظه: من المتوقع أن ينتج كل فأر ما يقرب من 60 × 10 6-100 × 10⁶ خلية.
6. خطط لتخطيط اللوحة المكونة من 12 بئرا لمقايسة تحفيز الموت / الالتهاب في المختبر المطلوبة. خطط لطبق 1 × 10⁶ خلايا لكل بئر. لكل تحفيز مخطط له ، قم بتضمين ما لا يقل عن ثلاثة مكررات بيولوجية ، ولوحة مجموعة واحدة من الآبار التي سيتم حصادها في مخزن تحلل كاسباز ومجموعة ثانية من الآبار ليتم حصادها في مخزن RIPA.
7. اللوحة 1 × 10⁶ خلايا في 1 مل من وسائط زراعة BMDM لكل بئر في ألواح 12 بئرا. استزراع بين عشية وضحاها في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية قبل الشروع في تقييم موت الخلية / التهابها. بعد الحضانة طوال الليل ، قم بإزالة الوسائط ، وأضف 1 مل من PBS الدافئ (37 درجة مئوية) إلى كل بئر لغسل الخلايا.
8. قم بإزالة غسل PBS وأضف 500 ميكرولتر من وسائط تحفيز BMDM مع المضادات الحيوية (في حالة إجراء التحفيز غير البكتيري) أو وسائط تحفيز BMDM بدون مضادات حيوية (في حالة إجراء التحفيز البكتيري) (الجدول 1). احتضن لمدة ساعتين قبل الانتقال إلى الخطوة 4 للتحفيز / العدوى في المختبر.

< p class = "jove_title" >4. تحفيز الخلايا أو إصابة الخلايا

تنبيه: العوامل المدرجة في هذا البروتوكول يحتمل أن تكون مسببة للأمراض ويجب التعامل معها بالاحتياطات المناسبة في منشأة السلامة البيولوجية من المستوى 2 (BSL2) بموافقة السلطات المؤسسية والحكومية ذات الصلة.

1. تحفيز BMDMs لتنشيط موت الخلايا مع مشغل الفائدة.
   ملاحظه: لأغراض هذا البروتوكول ، يتم استخدام فيروس الأنفلونزا A (IAV) ، وفيروس الهربس البسيط 1 (HSV1) ، و Francisella novicida ، و LPS + ATP للتوضيح ، ولكن يمكن استخدام محفزات أخرى.
   1. مثال التحفيز 1: العدوى ب IAV (A / Puerto Rico / 8/34 ، H1N1 [PR8]) (تم إنشاؤه وفقا ل Hoffmann et al. ؛ يتم حساب العيار الفيروسي لتحديد تعدد العدوى [MOI] بواسطة اختبار البلاك في خلايا MDCK):
      1. احسب حجم الفيروس اللازم للعدوى عند تعدد العدوى (MOI) البالغ 20 وحدة مكونة للبلاك (PFU) باستخدام المعادلة (1) والمعادلة (2):
         
         
         
   2. قم بإزالة الوسائط من BMDMs واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 500 ميكرولتر من PBS. أضف 450 ميكرولتر من IAV (20 MOI) في DMEM عالي الغلوكوز بدون مصل بقري جنيني معطل حرارة، (HI)-FBS لكل بئر. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في حاضنة رطبة للسماح بالامتصاص.
   3. قم بإزالة الأطباق وأضف 50 ميكرولتر من HI-FBS. أعد الألواح إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، احتضن لمدة 12 ساعة.

< p class = "jove_title" >5. جمع المواد الطافية والبروتين مجتمعة لاستخدامها في بقع الكاسباز الغربية

1. بعد 4 ساعات أو 12 ساعة أو 16 ساعة من الحضانة (يعتمد التوقيت المحدد على الزناد المستخدم) ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة.
2. قم بإزالة 150 ميكرولتر من المادة الطافية ؛ تخلص منها أو احفظها لتحليلات الطاف الأخرى (على سبيل المثال ، مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم [ELISA]). لا تقم بإزالة المادة الطافية المتبقية.
3. قم بإنشاء محلول جمع البروتين عن طريق الجمع بين 50 ميكرولتر من محلول تحلل الكاسباز + 100 ميكرولتر من 4x SDS buffer لكل بئر (الجدول 1). ثم أضف 150 ميكرولتر من المزيج إلى كل بئر.
4. لكل بئر ، قم بعمل ماصة الخليط لأعلى ولأسفل لجمع الخلايا المحللة والمادة الطافية. أثناء سحب العينات، اكشط قاع البئر أيضا بطرف الماصة لتعطيل الخلايا. بعد الكشط وسحب العينة ، اجمع محللات البروتين في أنابيب 1.5 مل مكتوبة.
5. استخدم كتلة حرارية لتسخين جميع الأنابيب إلى 100 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة.
6. بيليه أي مكونات غير قابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي عند 14,500 × جم لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: هذه نقطة توقف مؤقتة - يمكن استخدام البروتين من محلول الطاف والبروتين المركب على الفور أو تخزينه عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين أو عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر حتى يصبح جاهزا للاستخدام.

باب الكواشف اعداد ملاحظات احتياطات السلامة Media L929 وسائل الإعلام الثقافية 1) تعطيل الحرارة FBS (انظر الملاحظات).
2) امزج 43.5 مل من وسط Dulbecco المعدل من Iscove (IMDM) ، و 5 مل من مصل الأبقار الجنينية المعطل بالحرارة (HI-FBS) ، و 0.5 مل من بيروفات الصوديوم ، و 0.5 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 0.5 مل من البنسلين والستربتومايسين. قم بتعطيل FBS بالحرارة عن طريق الحضانة عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وسائط زراعة البلاعم المشتقة من نخاع العظام (BMDM) امزج بين 290 مل من IMDM و 150 مل من الوسائط المكيفة ب L929 و 5 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية و 50 مل من HI-FBS و 5 مل من البنسلين والستربتومايسين. قم بتسخين الوسائط إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي أو حبة قبل الاستخدام. يمكن تخزين الوسائط عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. وسائط تحفيز BMDM بالمضادات الحيوية امزج 445 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco و 50 مل من HI-FBS و 5 مل من البنسلين والستربتومايسين. قم بتسخين الوسائط إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي أو حبة قبل الاستخدام. يمكن تخزين الوسائط عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. وسائط تحفيز BMDM بدون مضادات حيوية امزج 450 مل من DMEM و 50 مل من HI-FBS. قم بتسخين الوسائط إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي أو حبة قبل الاستخدام. يمكن تخزين الوسائط عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. وسائط للعدوى (بدون HI-FBS) امزج 495 مل من DMEM عالي الجلوكوز مع 5 مل من البنسلين والستربتومايسين. قم بتسخين الوسائط إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي أو حبة قبل الاستخدام. يمكن تخزين الوسائط عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) 1 م تريس عازلة < br / > (للمخزن المؤقت SDS 4x) 1) قم بإذابة 12.11 جم من تريس في 80 مل من الماء منزوع الأيونات.
2) اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.8 عن طريق إضافة قطرات من حمض الهيدروكلوريك أثناء التحريك.
3) أضف الماء منزوع الأيونات لضبط الحجم النهائي إلى 100 مل. يمكن تخزين المخزن المؤقت عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. حمض الهيدروكلوريك مادة كاوية. ارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة ؛ سيشمل ذلك معطف المختبر والقفازات. يجب التعامل مع حمض الهيدروكلوريك في غطاء الدخان. 4x SDS المخزن المؤقت 1) امزج 60 مل من محلول 1 M Tris (درجة الحموضة 6.8) ، و 24 مجم من SDS ، و 100 مجم من البروموفينول الأزرق ، و 120 مل من الجلسرين ، و 8.4 مل من β-mercaptoethanol (BME) ، و 90 مل من الماء منزوع الأيونات. 2) قلبي على طبق تحريك دافئ للسماح للأملاح بالدخول إلى المحلول. 3) أضف الماء منزوع الأيونات لضبط الحجم النهائي إلى 300 مل. يمكن اقتباس المخزن المؤقت وتخزينه عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد. SDS مادة كاوية ، و BME مادة مسرطنة. ارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة ؛ سيشمل ذلك معطف المختبر والقفازات. يجب التعامل مع SDS و BME في غطاء الدخان. المخزن المؤقت لتحلل كاسباز 1 م 1،4-ديثيوثريتول (DTT) قم بإذابة 0.154 جم من مسحوق DTT في 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). اسمح ل DTT بالدخول في الحل. يمكن تقسيم المخزن المؤقت إلى 200 ميكرولتر وتخزينه عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام واحد. عازلة تحلل كاسباز امزج 35 مل من الماء منزوع الأيونات ، و 4 مل من NP-40 ، و 750 ميكرولتر من 1 M DTT ، و 1 قرص مثبط للبروتياز ، و 1 قرص مثبط للفوسفاتيز. يمكن تخزين المخزن المؤقت عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. المخزن المؤقت لمقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي (RIPA) 1.5 م تريس العازلة
(للمخزن المؤقت RIPA) 1) قم بإذابة 18.2 جم من تريس في 80 مل من الماء منزوع الأيونات.
2) اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.8 عن طريق إضافة قطرات من هيدروكسيد الصوديوم أثناء التحريك.
3) أضف الماء منزوع الأيونات لضبط الحجم النهائي إلى 100 مل. يمكن تخزين المخزن المؤقت عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. هيدروكسيد الصوديوم مادة للتآكل ويمكن أن تسبب حروقا. ارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة ؛ سيشمل ذلك معطف المختبر والقفازات. 10٪ (بالوزن / حجم الحجم) حل SDS
(للمخزن المؤقت RIPA) 1) أضف 10 جم من SDS إلى 80 مل من الماء منزوع الأيونات.
2) يقلب حتى يذوب.
3) أضف الماء منزوع الأيونات لضبط الحجم النهائي إلى 100 مل. يمكن تخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر. إذا ترسب المحلول ، سخنه برفق لإعادة الذوبان. SDS مادة كاوية. ارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة ؛ سيشمل ذلك معطف المختبر والقفازات. يجب التعامل مع SDS في غطاء الدخان. RIPA buffer
(2x مخزون) 1) امزج 0.5 جم من ديوكسي كولات الصوديوم ، و 1 مل من NP-40 ، و 0.876 جم من كلوريد الصوديوم ، و 3.3 مل من 1.5 M Tris (درجة الحموضة 8.8) ، و 1 مل من 10٪ (بالوزن / الحجم) SDS في 46 مل من الماء منزوع الأيونات.
2) يقلب حتى يذوب.
3) أضف الماء منزوع الأيونات لضبط الحجم النهائي إلى 50 مل. يمكن تخزين مخزون 2x RIPA عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. SDS مادة كاوية. ارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة ؛ سيشمل ذلك معطف المختبر والقفازات. يجب التعامل مع SDS في غطاء الدخان. مشغلات معقمة لبس قم بإذابة LPS المجفف بالتجميد من بكتريا قولونية 0111: B4 في ماء خال من السموم الداخلية بتركيز 5 مجم / مل. يمكن تخزين المحلول عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عامين. 0.5 م ATP قم بإذابة 1 جم من ATP المجفف بالتجميد في 3.63 مل من الماء الخالي من السموم الداخلية. يمكن نقل المحلول وتخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عامين. حلول النشاف الغربية تشغيل المخزن المؤقت
(5x مخزون) 1) امزج 15 جم من قاعدة تريس و 72 جم من الجلايسين و 5 جم من SDS في 900 مل من الماء منزوع الأيونات.
2) قلبي حتى تختفي الجسيمات.
3) أضف الماء منزوع الأيونات لضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر. يمكن تخزين المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر. SDS مادة كاوية. ارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة ؛ سيشمل ذلك معطف المختبر والقفازات. يجب التعامل مع SDS في غطاء الدخان. المخزن المؤقت للنقل
(10x مخزون) 1) امزج 30.3 جم من قاعدة تريس و 72 جم من الجلايسين في 900 مل من الماء منزوع الأيونات.
2) قلبي حتى تختفي الجسيمات.
3) أضف الماء منزوع الأيونات لضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر. يمكن تخزين المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 3 أشهر. محلول ملحي مخزن ثلاثي مع توين 20 (TBST) 1) قم بإذابة 2.42 جم من قاعدة تريس و 8.76 جم من كلوريد الصوديوم في 850 مل من الماء منزوع الأيونات.< br / > 2) اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 عن طريق إضافة قطرات من حمض الهيدروكلوريك أثناء التحريك.
3) أضف الماء منزوع الأيونات لضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر < / > 4) أضف 0.5 مل من Tween 20 (التركيز النهائي 0.05٪ (حجم / حجم)). يمكن تخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 شهر. حمض الهيدروكلوريك مادة كاوية. ارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة ؛ سيشمل ذلك معطف المختبر والقفازات. يجب التعامل مع حمض الهيدروكلوريك في غطاء الدخان. 5٪ (الوزن / الحجم) محلول حجب الحليب الخالي من الدسم قم بإذابة 5 جم من الحليب المجفف المجفف الخالي من الدسم في 100 مل من TBST. يمكن تخزين المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. الأجسام المضادة الأولية الجسم المضاد الأولي Caspase-1 قم بتخفيف الجسم المضاد المضاد للكاسباز -1 1: 1,000 (vol / vol) عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من الجسم المضاد إلى 10 مل من محلول حجب الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ (بالوزن / الحجم). للحصول على أفضل النتائج ، اجعلها طازجة لكل تجربة. ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا الحل 3 مرات على الأقل دون فقدان الفعالية. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في حالة إعادة الاستخدام. الجسم المضاد الأولي Caspase-11 قم بتخفيف الجسم المضاد المضاد للكاسباز 11 1: 1,000 (حجم / حجم) عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من الجسم المضاد إلى 10 مل من محلول حجب الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ (بالوزن / الحجم). للحصول على أفضل النتائج ، اجعلها طازجة لكل تجربة. ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا الحل 3 مرات على الأقل دون فقدان الفعالية. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في حالة إعادة الاستخدام. الجسم المضاد الأولي Caspase-3 قم بتخفيف الجسم المضاد للكاسباز -3 والجسم المضاد للكاسباز 3 المضاد للشقوق 1: 1,000 (حجم / حجم) بإضافة 10 ميكرولتر من كل جسم مضاد إلى نفس 10 مل من محلول منع الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ (بالوزن / الحجم). للحصول على أفضل النتائج ، اجعلها طازجة لكل تجربة. ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا الحل 3 مرات على الأقل دون فقدان الفعالية. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في حالة إعادة الاستخدام. الجسم المضاد الأولي Caspase-7 قم بتخفيف الجسم المضاد المضاد للكاسباز 7 والجسم المضاد للكاسباز 7 المضاد للشقوق 1: 1,000 (vol / vol) بإضافة 10 ميكرولتر من كل جسم مضاد إلى نفس 10 مل من محلول حجب الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ (بالوزن / الحجم). للحصول على أفضل النتائج ، اجعلها طازجة لكل تجربة. ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا الحل 3 مرات على الأقل دون فقدان الفعالية. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في حالة إعادة الاستخدام. الجسم المضاد الأولي Caspase-8 قم بتخفيف الجسم المضاد المضاد للكاسباز 8 والجسم المضاد للكاسباز 8 المضاد للشقوق 1: 1,000 (vol / vol) عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من كل جسم مضاد إلى نفس 10 مل من محلول حجب الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ (بالوزن / الحجم). للحصول على أفضل النتائج ، اجعلها طازجة لكل تجربة. ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا الحل 3 مرات على الأقل دون فقدان الفعالية. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في حالة إعادة الاستخدام. الجسم المضاد الأولي Caspase-9 قم بتخفيف الجسم المضاد المضاد للكاسباز 9 1: 1,000 (vol/vol) بإضافة 10 ميكرولتر من الجسم المضاد إلى 10 مل من محلول منع الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ (بالوزن / الحجم). للحصول على أفضل النتائج ، اجعلها طازجة لكل تجربة. ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا الحل 3 مرات على الأقل دون فقدان الفعالية. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية في حالة إعادة الاستخدام. الجسم المضاد الأولي المترافق ب HRP β-actin قم بتخفيف الجسم المضاد المضاد β الأكتين 1: 5,000 (vol / vol) عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من الجسم المضاد إلى 10 مل من محلول حجب الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ (بالوزن / الحجم). يجب تحضير هذا الجسم المضاد طازجا لكل تجربة. الأجسام المضادة الثانوية الأجسام المضادة للأرانب قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي المترافق ببيروكسيداز الفجل (HRP) 1: 5,000 (vol: vol) عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من الجسم المضاد إلى 10 مل من محلول حجب الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ (بالوزن / الحجم). يجب تحضير تخفيف الأجسام المضادة طازجا في كل مرة. الأجسام المضادة للفأر تمييع الجسم المضاد الثانوي المترافق ب HRP 1: 5,000 (vol: vol) عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من الجسم المضاد إلى 10 مل من محلول حجب الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ (بالوزن / الحجم). يجب تحضير تخفيف الأجسام المضادة طازجا في كل مرة. الأجسام المضادة للفئران تمييع الجسم المضاد الثانوي المترافق ب HRP 1: 5,000 (vol: vol) عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من الجسم المضاد إلى 10 مل من محلول حجب الحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ (بالوزن / الحجم). يجب تحضير تخفيف الأجسام المضادة طازجا في كل مرة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مرشح 0.45 ميكرومتر ميليبور SCHVU05RE حقنة 10 مل BD Biosciences 309604 طبق 12 بئر كورنينج 07-200-82 18 جرام إبرة BD Biosciences 305195 25 جرام إبرة BD Biosciences 305122 أنبوب 50 مل فيشر ساينتيك 50-809-218 مصفاة خلية 70 ميكرومتر كورنينج 431751 أطباق زراعة الأنسجة 150 مم كورنينج 430597 قارورة زراعة الأنسجة 182 سم 2 جينيسي العلمية 25-211 ATP إنفيفوجين TLRL-ATPL BBL مرق الصويا Trypticase BD Biosciences 211768 حمام حبة كيم جلاس لعلوم الحياة CLS-4598-009 مقياس الضوء الحيوي D30 إيبندورف 6133000010 كاشطات الخلية منتجات سيلتريت العلمية 229315 غرفة CO2 فيكيب 901703 كوفيت فيشر ساينتيك 14-955-129 تشريح مقص ثيرمو فيشر العلمي 221 ثانية DMEM ثيرمو فيشر العلمي 11995-073 ايثانول فارمكو 111000200 مصل الأبقار الجنينية الغرب الحيوي S1620 ورق الترشيح بيو راد 1703965 ملقط فيشر ساينتيك 22-327379 فرانسيسيلا نوفيتشيدا (سلالة تحت 112) موارد BEI رقم 13 جنتاميسين جيبكو 15750060 كتلة الحرارة فيشر ساينتيك 23-043-160 فيروس الهربس البسيط 1 (سلالة HF) ATCC في آر -260 ارتفاع نسبة الجلوكوز DMEM سيغما د6171 حاضنة مرطب ثيرمو فيشر العلمي 51026282 IMDM ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 12440-053 فيروس الأنفلونزا A (A/Puerto Rico/8/34 وH1N1 [PR8]) شيدت لكل هوفمان وآخرون. خلايا L929 ATCC CCL-1 خط خلية لإنشاء وسائط مكيفة L929 L-سيستين ثيرمو فيشر العلمي BP376-100 خلايا MDCK ATCC CCL-34 خط الخلية لتحديد عيار الفيروس IAV أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ثيرمو فيشر العلمي 75002401 الأحماض الأمينية غير الأساسية جيبكو 11140050 حل NP-40 سيغما 492016 برنامج تلفزيوني ثيرمو فيشر العلمي 10010023 البنسلين والستربتومايسين سيغما ص 4333 طبق بتري فيشر ساينتيك 07-202-011 فوسستوب روش فوس-RO مصدر الطاقة بيو راد 164-5052 قرص مثبط للبروتياز سيغما S8820 هيدروكسيد الصوديوم سيغما 72068 بيروفات الصوديوم جيبكو هاتف: 11360-070 طبق بتري مربع فيشر ساينتيك FB0875711A جهاز طرد مركزي منضدية ثيرمو فيشر العلمي 75004524 عديد السكاريد الدهني فائق النقاء (LPS) من الإشريكية القولونية 0111: B4 إنفيفوجين TLRL-3PELPS خلايا فيرو ATCC CCL-81 خط الخلية لتحديد عيار فيروس الهربس البسيط من النمط 1