مقالة منهجية

فحص متعدد الإرسال قائم على الخرزة لتحليل السيتوكينات في عينات الدموع البشرية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Balne ، P. K. ، et al. مقايسة متعددة الإرسال القائمة على الخرزة لتحليل ملامح السيتوكين المسيل للدموع. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو مقايسة متعددة الإرسال قائمة على الخرزة لتحليل السيتوكينات في الدموع البشرية. تسمح الطريقة بالتحليل المتزامن للسيتوكينات المتعددة من عينة واحدة ، مما يوفر حساسية معززة لدراسة الاستجابات المناعية في مختلف الحالات الفيزيولوجية المرضية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. تحليل السيتوكين المسيل للدموع

  1. مجموعة من الدموع:
    1. اطلب من الشخص الجلوس بشكل مريح على كرسي الفحص ووضع رأسه على مسند الرأس.
    2. اطلب من الشخص أن ينظر لأعلى ، وافتح بعناية شرائط Schirmer (المصنوعة من ورق ترشيح Whatman رقم 41) ، ضع الطرف المستدير للشريط على الجزء السفلي من العين ، واطلب من الشخص إغلاق العينين لمدة 5 دقائق. أثناء جمع الدموع ، احرص بشدة على تقليل ملامسة سطح العين.
    3. اطلب من الشخص أن يفتح عينيه لإزالة الشريط ووضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل. انقل الأنبوب على الفور إلى المختبر أو قم بتخزينه في درجة حرارة -80 درجةمئوية حتى اختبار تحديد ملامح السيتوكين.
  2. شطف عينة المسيل للدموع من شريط التدفق المسيل للدموع:
    1. قم بقص شريط التدفق المسيل للدموع بطول 0.5 سم (لتوحيد كمية الدموع المراد اختبارها) وضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل.
    2. أضف 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق متبوعا بالطرد المركزي للأنبوب عند 14,000 × جم لمدة دقيقة واحدة.
    3. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق آخر سعة 1.5 مل وتخلص من الشريط. ضع العينة التي تحتوي على الأنبوب على الجليد واستخدم عينة المسيل للدموع المملوءة على الفور لتنميط السيتوكين.
  3. تحضير الكواشف:
    ملاحظة: التحليلات الواحد والأربعون التي سيتم اختبارها في كل عينة عن طريق مقايسة تعدد الإرسال القائم على الخرزة هي الإنترلوكين (IL) -1α ، IL-1β ، IL-Rα ، IL-2 ، IL-3 ، IL-4 ، IL-5 ، IL-6 ، IL-7 ، IL-8 ، IL-9 ، IL-10 ، IL-12 p40 ، IL-12 p70 ، IL-13 ، IL-15 ، IL-17A ، الإنترفيرون ألفا (IFN- α) 2 ، IFN-γ ، البروتين المحفز ل IFN-gamma 10 (IP-10 ، CXCL10) ، الكيموكين المشتق من البلاعم (MDC) ، بروتين التهاب البلاعم (MIP) -1α و MIP-1β ، البروتين الكيميائي أحادي الخلية (MCP) -1 ، MCP-3 ، عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) ، TNF-β ، الجين الورمي المنظم للنمو (GRO) ، عامل نمو الورم ألفا (TGF-α) ، عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF) ، عامل نمو البشرة (EGF) ، عامل نمو الخلايا الليفية (FGF) -2 ، عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF) -AA ، PDGF-AB / BB ، عامل تحفيز مستعمرة الخلايا الحبيبية (G-CSF) ، عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم (GM-CSF) ، يوتاكسين ، فراكستالكين ، ترابط CD40 القابل للذوبان (sCD40L) ، تيروزين كيناز 3 ليجند يشبه FMS (Flt-3L) ويتم تنظيمه عند التنشيط ، الخلية التائية الطبيعية المعبر عنها والمفرزة (RANTES).
    1. أحضر قوارير محلول حبة الأجسام المضادة (50X) إلى درجة حرارة الغرفة (20-25 درجةمئوية) وقم بتدوير القوارير لمدة 1 دقيقة.
    2. احسب عدد الآبار المطلوبة للفحص ، واحسب كمية إجمالي محلول كوكتيل حبة الأجسام المضادة (25 ميكرولتر لكل بئر) وكل محلول حبة أجسام مضادة (50X) المطلوب للمقايس.
    3. قم بإعداد محلول الكوكتيل عن طريق إضافة الكمية المحسوبة لكل محلول حبة الجسم المضاد واملأه إلى الحجم النهائي المطلوب بإضافة الكمية المتبقية من مخفف الخرزة. تأكد من أن التركيز النهائي لكل جسم مضاد في الكوكتيل هو 1X. قم دائما بإعداد حجم إضافي بنسبة 20٪ على الأقل من محلول الكوكتيل في حالة حدوث أخطاء في سحب العينات.
      ملاحظه: على سبيل المثال ، بالنسبة لفحص 96 بئرا ، قم بإعداد 3000 ميكرولتر من محلول كوكتيل حبة الأجسام المضادة. الكمية المطلوبة من كل محلول حبة الجسم المضاد = 3000 / تركيز مخزون لكل محلول حبة الجسم المضاد ؛ 3000/50 = 60 ميكرولتر من كل محلول حبة الجسم المضاد
      1. أضف 60 ميكرولتر من كل محلول من محاليل حبة الأجسام المضادة البالغ عددها 41 (60 × 41 = 2460 ميكرولتر) في زجاجة كوكتيل وأضف 540 ميكرولتر من محلول مخفف الخرزة إلى خليط حبة الجسم المضاد لصنع 3000 ميكرولتر من محلول العمل النهائي (1X).
      2. قبل الاستخدام ، اخلطي محلول كوكتيل الخرز بشكل صحيح. بعد الفحص ، قم بتخزين الحجم المتبقي عند 2-8 درجةمئوية لمدة تصل إلى 30 يوما.
    4. إعداد ضوابط الجودة (QC) بإضافة 250 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى مخزونات مراقبة الجودة 1 ومراقبة الجودة 2.
    5. تخلط بشكل صحيح عن طريق قلب الزجاجات عدة مرات والدوامة لمدة 10 ثوان. انقل المحلول إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المصنوعة من مادة البولي بروبلين الملصقة بشكل صحيح وقم بتخزين المحلول المتبقي عند درجة حرارة -20 درجةمئوية والتي يمكن استخدامها لمدة تصل إلى 30 يوما.
    6. قم بإعداد مخزن الغسيل المؤقت عن طريق إضافة 270 مل من الماء منزوع الأيونات إلى 30 مل من محلول الغسيل العازل 10X واخلطه جيدا (قبل التخفيف ، أحضر المخزن المؤقت 10X إلى درجة حرارة الغرفة وقم بإذابة جميع رواسب الملح عن طريق الخلط). قم بتخزين مخزن الغسيل غير المستخدم (1X) عند 2-8 درجات مئويةوالذي يمكن استخدامه لمدة تصل إلى 30 يوما.
    7. قم بإعداد مخزون السيتوكين البشري القياسي (10,000 بيكوغرام / مل من جميع التحليلات) عن طريق إضافة 250 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى قارورة المخزون. تخلط جيدا عن طريق قلب القارورة عدة مرات وتدوير القارورة لمدة 10 ثوان. اتركه لمدة 10 دقائق وانقل محلول المخزون إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المصنوعة من مادة البولي بروبلين المصنفة بشكل صحيح. بعد الفحص ، قم بتخزين المحلول المتبقي عند -20 درجةمئوية ، والذي يمكن استخدامه لمدة تصل إلى 30 يوما.
    8. قم بإعداد معايير السيتوكين البشري العاملة عن طريق التخفيفات التسلسلية 5 أضعاف (50 ميكرولتر -> 200 ميكرولتر) مع مخزن مؤقت للفحص للحصول على 2000 و 400 و 80 و 16 و 3.2 بيكوغرام / مل.
    9. بعد التحضير القياسي ، استخدم معايير العمل في غضون 60 دقيقة واستخدم المخزن المؤقت للفحص كفارغ / خلفية (-pg / mL).
  4. توصيف السيتوكين عن طريق مقايسة تعدد الإرسال القائم على الخرز:
    1. قم بإحضار جميع الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة والدوامة لمدة 5-10 ثوان قبل إضافتها إلى لوحة الميكروتيتر المكونة من 96 بئرا. إذا تم تخزين عينات المسيل للدموع المخففة عند -80 درجةمئوية قبل الفحص ، فقم بإذابة مستخلصات المسيل للدموع المجمدة على الجليد وأجهزة الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق.
    2. قم بإعداد ورقة عمل الفحص في تكوين رأسي لمعايير السيتوكين البشري العاملة [0 (فارغ) و 3.2 و 16 و 80 و 400 و 2,000 و 10,000 بيكوغرام / مل] و QC1 و QC2 والعينات.
    3. أضف 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل 1X إلى كل بئر من اللوحة ، وأغلقه باستخدام مانع تسرب اللوحة ، واحتفظ به على شاكر اللوحة في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجةمئوية) لمدة 10 دقائق.
    4. صب عازلة الغسيل 1X عن طريق قلب اللوحة وتثبيتها على مناشف ماصة عدة مرات لإزالة أي كمية متبقية من عازلة الغسيل في الآبار.
    5. أضف 25 ميكرولتر من كل معيار سيتوكين بشري عامل ، QC1 ، QC2 ، فارغ (مخزن مؤقت للفحص) ، وعينات في الآبار المناسبة.
    6. أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص في كل بئر.
    7. أضف 25 ميكرولتر من محلول كوكتيل حبة الأجسام المضادة 1X في كل بئر. نظرا لأن محلول حبة الجسم المضاد حساس للضوء ، فقم بإغلاق اللوحة بمادة مانعة للتسرب وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء أثناء الفحص.
    8. احتضن الطبق عند 4 درجاتمئوية طوال الليل على شاكر.
    9. ضع اللوحة على رف اللوحة لغسالة اللوحة المغناطيسية الأوتوماتيكية. اتركه لمدة 1 دقيقة لتسوية الخرز المغناطيسي في قاع البئر واستنشاق محتويات البئر. أضف 200 ميكرولتر من محلول الغسيل لكل بئر ، واتركه لمدة 1 دقيقة ثم استنشق محتويات البئر. كرر الغسيل مرة أخرى (لغسل الطبق ، اتبع تعليمات الشركة المصنعة للمجموعة).
    10. أضف 25 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة للكشف في كل بئر ، وأغلق اللوحة ، وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة على شاكر.
    11. أضف 25 ميكرولتر من محلول Streptavidin-Phycoerythrin في كل بئر ، وأغلق اللوحة ، وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر.
    12. ضع اللوحة على غسالة لوحة مغناطيسية. اتركه لمدة 1 دقيقة ثم استنشق محتويات البئر. أضف 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل لكل بئر. اتركه لمدة 1 دقيقة ثم استنشق محتويات البئر. كرر الغسيل مرة أخرى.
    13. أضف 150 ميكرولتر من سائل الغمد إلى كل بئر وضع الطبق على شاكر لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإعادة تعليق حبات الأجسام المضادة.
    14. اقرأ اللوحة على الفور باستخدام قارئ لوحة الفحص المتعدد القائم على الخرزة وقم بتحليل تركيزات السيتوكين باستخدام خوارزمية تركيب منحنى من 5 معلمات. يظهر مخطط التدفق التخطيطي لتنميط السيتوكين المسيل للدموع في الشكل 1.
  5. قراءة لوحة الفحص (إعداد الأداة) وتحليل البيانات:
    1. قم بتشغيل قارئ الفحص المتعدد القائم على الخرزة وقم بتسخين الليزر مسبقا لمدة 30 دقيقة.
    2. قم بتشغيل برنامج فحص تعدد الإرسال القائم على الخرز. ضمن علامة التبويب "الصيانة الآلية"، حدد خيار "معايرة التحقق". دوامة كل قارورة كاشف من حبات المعايرة والتحقق لمدة 30 ثانية. ضع 5 قطرات من كل كاشف في الآبار المخصصة. املأ الخزانات المخصصة بالماء منزوع الأيونات و 70٪ من الإيثانول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: مخطط التدفق التخطيطي لتنميط السيتوكين المسيل للدموع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Milliplex MAP السيتوكين البشري / كيموكين لوحة حبة مغناطيسية -1 كيت ميرك ، الولايات المتحدة الأمريكية HCYTOMAG-60K-41 أداة Flexmap 3D luminex شركة Luminex Corp ، أوستن ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية برنامج xPonent شركة Luminex Corp ، أوستن ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية برنامج RBXGenerator BIO-RAD, فرنسا مدير البيو بلكس 6.1 BIO-RAD, فرنسا شاكر لوحة كورنينج ، الولايات المتحدة الأمريكية TECAN غسالة Microplate تيكان ، سويسرا هيدرو سبيد الماصات ميتلر توليدو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق Axygen ، الولايات المتحدة الأمريكية MCT-150-C شريط اختبار تدفق المسيل للدموع Schirmer العناية بالعيون والعلاج ، الولايات المتحدة الأمريكية 101657 طقم معايرة Flexmap 3D شركة Luminex Corp ، أوستن ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية 40-028 مجموعة التحقق من Flexmap 3D شركة Luminex Corp ، أوستن ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية 40-029 كرسي فحص العين

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة