مقالة منهجية

استخدام مضان الحمض النووي الريبي المناعي في الموقع لتصور SARS-CoV-2

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Kula-Pacurar, A., et al. تصور SARS-CoV-2 باستخدام التهجين المناعي للحمض النووي الريبي الفلوري في الموقع. J. Vis. Exp. (166) ، (2020).

يوضح هذا الفيديو تطبيق تفاعل التهجين المتسلسل (HCR) - التهجين الفلوري في الموقع (FISH) لتصور التوزيع المكاني للحمض النووي الريبي الفرعي SARS-CoV-2. إن الجمع بين HCR وتقنيات التألق المناعي لديه القدرة على توفير رؤى حول تفاعلات الفيروس المضيف على مستوى الخلية الواحدة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. SARS-CoV-2 RNA-FISH في خلايا Vero المستزرعة على أغطية

< ص الفئة = "jove_content" > اليوم 1

  1. تثبيت الخلايا ونفاذها
    1. إصلاح الخلايا المصابة باستخدام 3.7٪ وزن / حجم محلول PFA لمدة 1 ساعة في RT.
    2. استنشق محلول PFA بنسبة 3.7٪ ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام 1x PBS.
    3. تخلل الخلايا بمحلول PBST لمدة 10 دقائق في RT مع التحريض.
    4. استنشق PBST ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام 1x PBS.
  2. الكشف
    1. قم بشفط محلول 1x PBS ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام 2x SSC في RT.
    2. قم بشفط محلول 2x SSC ، وقم بتهجين العينات مسبقا عن طريق إضافة 300 ميكرولتر على الأقل من المخزن المؤقت لتهجين المسبار. قم بتغطية الآبار التي تحتوي على الخلايا ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. قم بإعداد محلول المسبار عن طريق إضافة 1.2 مليون دولار من خليط المسبار إلى مخزن تهجين المسبار.
      1. استخدم 1.2 ميكرولتر من مخزون المسبار 1 ميكرومتر لتحضير 300 ميكرولتر من مخزون العمل.
    4. قم بإزالة محلول التهجين المسبق ، وانقل الغطاء إلى غرفة مرطبة.
      1. الماصة 30-50 ميكرولتر من محلول المسبار على البارافيلم لتشكيل قطرات فردية.
    5. احتضان العينات طوال الليل (12-18 ساعة) عند 37 درجة مئوية.
< ص الفئة = "jove_content" > اليوم 2

  1. انقل الغطاء مرة أخرى إلى لوح 12 بئرا ، وقم بإزالة محلول المسبار الزائد عن طريق الغسيل لمدة 4 × 5 دقائق باستخدام 400 ميكرولتر من مخزن غسيل المسبار عند 37 درجة مئوية
    ملاحظه: كبديل لوضع 30-50 ميكرولتر من الحصص على البارافيلم وتحت أغطية للحضانة ، أضف 300 ميكرولتر من محلول المسبار مباشرة إلى الغطاء في صفيحة 12 بئرا. هذا الإجراء أبسط ولكنه يتطلب كميات كبيرة من الكواشف. قم بتسخين مخزن غسيل المسبار إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. احسب كمية المخزن المؤقت المطلوب ، وانقله إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل.
  2. اغسل العينات لمدة 2 × 5 دقائق باستخدام 5x SSCT في RT.
  3. استبدل محلول SSCT 5x ب 1x PBS ، وقم بتخزين العينات عند 4 درجات مئوية حتى التضخيم.
< p class = "jove_content" >3. تضخيم

  1. قم بإزالة محلول 1x PBS من الآبار ، وأضف ما لا يقل عن 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتضخيم إلى كل بئر. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في RT.
  2. قم بإعداد كل دبوس شعر HCR (h1 و h2) عن طريق تبريد الحجم المطلوب في أنابيب منفصلة.
    1. لتحضير 300 ميكرولتر من محلول التضخيم ، استخدم 18 ميكرولتر من كل دبوس شعر (على سبيل المثال ، ل 300 ميكرولتر ، استخدم 6 ميكرولتر من محلول دبوس الشعر 3 ميكرومتر).
    2. انقل محلول دبوس الشعر إلى أنابيب.
    3. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 90 ثانية.
    4. تبرد إلى RT لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  3. قم بإعداد خليط دبوس الشعر عن طريق إضافة دبابيس الشعر "h1" و "h2" المبردة بشكل مفاجئ إلى مخزن التضخيم.
  4. ضع قطرات من 30-50 ميكرولتر من خليط دبوس الشعر على البارافيلم.
  5. احتضان العينات بين عشية وضحاها (12-18 ساعة) في الظلام في RT.
< p class = "jove_content" > اليوم 3

  1. انقل الغطاء مرة أخرى إلى اللوحة المكونة من 12 بئرا ، وقم بإزالة دبابيس الشعر الزائدة عن طريق الغسيل لمدة 5 × 5 دقائق باستخدام 5x SSCT عند RT مع التحريض.
  2. استنشق المخزن المؤقت SSCT 5x ، واستبدله ب 1x PBS.
    ملاحظه: إذا لزم الأمر ، استخدم عينات RNA-FISH في مقايسة التألق المناعي القياسية ، متبوعة بتلوين النوى (انظر القسم 1.4).
فئة < p = "jove_content" >4. تلطيخ نووي وتركيب منزلق

  1. استنشق محلول 1x PBS ، واستبدله ب 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ، 0.2 ميكروغرام / مل) في محلول 1x PBS.
  2. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في RT في الظلام.
  3. استنشق محلول DAPI ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام 1x PBS.
  4. ضع قطرتين سعة كل منهما 10 ميكرولتر من وسط التركيب ؛ تأكد من فصل القطرات بشكل كاف للسماح بوضع غطاءين على شريحة واحدة.
  5. قم بإزالة السوائل الزائدة عن طريق النقر على أغطية على منشفة نظيفة ، ثم ضعها في وسط تثبيت مضاد للبهتان بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل.
  6. ضع العينات المثبتة على سطح جاف ومستو في الظلام واتركها تشفى.
  7. بعد المعالجة ، قم بإغلاق حواف الغطاء باستخدام مادة مانعة للتسرب VALAP أو طلاء الأظافر لمنع جفاف العينات.
فئة

2. SARS-CoV-2 RNA-FISH في مزارع الوذمة الوعائية

< ص الفئة = "jove_content" > اليوم 1

  1. تثبيت ثقافة الوذمة الوعائية الوعائية وتنفذها
    1. استنشق الوسط ، وقم بإصلاح الخلايا المصابة باستخدام محلول PFA 3.7٪ لمدة ساعة واحدة في RT.
    2. استنشق محلول PFA بنسبة 3.7٪ ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام 1x PBS.
      1. استبدل محلول PFA بنسبة 3.7٪ ب 1x PBS تحت ملحق Transwell.
    3. تخلص من PBS ، وقم بتجفيف العينات باستخدام غسلات 2 × 5 دقائق مع 100٪ MeOH مبرد مسبقا إلى -20 درجة مئوية.
    4. بعد الغسيل الثاني ، استبدل المخزن المؤقت ب MeOH طازج ومبرد للنفاذية أسفل ملحق Transwell. يحفظ طوال الليل عند -20 درجة مئوية.
< ص الفئة = "jove_content" > اليوم 2

  1. الجفاف
    أعد ترطيب العينات من خلال سلسلة متدرجة من محاليل MeOH / PBST (كل منها لمدة 5 دقائق) على الجليد: 75٪ MeOH / 25٪ PBST ، 50٪ MeOH / 50٪ PBST ، 25٪ MeOH / 75٪ PBTS ، و 100٪ PBST (مرتين).
    1. اغسل الخلايا لمدة 5 دقائق على الثلج باستخدام 50٪ 5x SSCT / 50٪ PBST.
    2. اغسل الخلايا لمدة 5 دقائق على الثلج باستخدام 5x SSCT.
    3. استبدل المخزن المؤقت SSCT 5x ب 1x PBS.
  2. الكشف
    1. احتضان الخلايا (داخل ملحق Transwell) لمدة 5 دقائق على الجليد مع 100 ميكرولتر من مخزن تهجين المسبار. بعد ذلك ، انقل اللوحة إلى حاضنة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية (التهجين المسبق).
      ملاحظه: يجب تسخين مخزن تهجين المسبار مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. احسب الحجم المطلوب: هناك حاجة إلى 100 ميكرولتر لإدراج Transwell واحد.
    2. تحضير محلول المسبار. نظرا لأن 1 مل من محلول المسبار يتطلب 4 مللي مول من المسبار ، أضف 4 ميكرولتر من محلول مخزون المسبار 1 ميكرومتر إلى 1 مل من المخزن المؤقت لتهجين المسبار ، واخلطه جيدا.
      ملاحظه: للكشف عن الحمض النووي الريبي ، استخدم 100 ميكرولتر من محلول المسبار لكل إدراج Transwell. اترك محلول المسبار على الجليد حتى نهاية خطوة التهجين المسبق.
    3. قم بإزالة محلول التهجين المسبق ، وأضف محلول المسبار.
    4. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها (12-18 ساعة) عند 37 درجة مئوية.
< p class = "jove_content" > اليوم 3

  1. قم بإزالة المسبار الزائد عن طريق الغسيل لمدة 4 × 15 دقيقة باستخدام 100 ميكرولتر من مخزن غسيل المسبار عند 37 درجة مئوية.
  2. اغسل العينات لمدة 2 × 5 دقائق باستخدام 5x SSCT في RT.
  3. استبدل 5x SSCT ب 1x PBS ، وقم بتخزين العينات عند 4 درجات مئوية حتى التضخيم.
  1. التضخيم
  1. قم بتضخيم العينات مسبقا عن طريق احتضانها بمخزن مؤقت للتضخيم لمدة 30 دقيقة في RT.
  2. قم بإعداد كل دبوس شعر عن طريق تبريد الأحجام المطلوبة في أنابيب منفصلة.
    1. لتحضير 500 ميكرولتر من محلول التضخيم ، استخدم 30 ميكرولتر من كل دبوس شعر (على سبيل المثال ، ل 500 ميكرولتر ، استخدم 10 ميكرولتر من محلول دبوس الشعر 3 ميكرومتر).
    2. انقل محلول دبوس الشعر إلى الأنابيب.
    3. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 90 ثانية.
    4. تبرد إلى RT لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  3. قم بإعداد محلول دبوس الشعر عن طريق إضافة جميع دبابيس الشعر المبردة بشكل مفاجئ إلى 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتضخيم في RT.
  4. قم بإزالة محلول التضخيم المسبق ، وأضف محلول دبوس الشعر الكامل.
  5. احتضان العينات بين عشية وضحاها (12-18 ساعة) في RT في الظلام.
  6. قم بإزالة دبابيس الشعر الزائدة عن طريق الغسيل باستخدام 5x SSCT في RT على النحو التالي: 2 × 5 دقائق ، 2 × 15 دقيقة ، و 1 × 5 دقائق.
  7. استبدل محلول SSCT 5x ب 1x PBS ، وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 2-3 أيام ، أو انتقل مباشرة إلى التلوين النووي.
    ملاحظه: إذا لزم الأمر ، استخدم عينات RNA-FISH في مقايسة التألق المناعي القياسية ، متبوعة بالتلوين النووي (انظر القسم 3).
فئة

5. تلطيخ نووي وتركيب منزلق

  1. استنشق محلول 1x PBS ، واستبدله بمحلول DAPI (0.2 ميكروغرام / مل) في 1x PBS.
  2. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في RT في الظلام.
  3. استنشق محلول DAPI ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام 1x PBS.
  4. ضع الغشاء المقطوع من إدخالات Transwell على 10 ميكرولتر من وسط التثبيت المضاد للبهتان بحيث تكون الخلايا متجهة لأعلى ، وأضف وسيطا إضافيا للتركيب (5 ميكرولتر) إلى الغشاء.
  5. قم بتغطية الأغشية بأغطية.
  6. عالج العينات المركبة على سطح جاف ومستو في الظلام.
  7. بعد المعالجة ، قم بإغلاق حواف الغطاء باستخدام مادة مانعة للتسرب VALAP أو طلاء الأظافر لمنع جفاف العينات.
فئة

3. تحليل التألق المناعي لخلايا Vero ومزارع الوذمة الوعائية الوعائية

ملاحظة: قم بإجراء مقايسة التألق المناعي في اليوم 3 لخطوط الخلايا أو اليوم 4 لمزارع الوذمة الوعائية الوعائية (HAE). استخدم نهجا مختلفا لكل نموذج. يشار إلى جميع الاختلافات بوضوح.

  1. استنشق محلول 1x PBS من الآبار.
  2. قم بحظر العينات عن طريق الحضانة باستخدام 1٪ وزن / حجم ألبومين مصل الأبقار في محلول PBST لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. تحضير الأجسام المضادة الأولية عن طريق تحضير التخفيفات المناسبة في محلول الحجب ، واحتضانها.
    1. لخلايا Vero على أغطية:
      1. ضع قطرات (30-50 ميكرولتر) من محلول الأجسام المضادة على البارافيلم في غرفة الرطوبة.
      2. ضع الغطاء على قطرات الجسم المضاد بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل.
    2. بالنسبة للذمة الوعائية الوراثية ، استبدل عامل الحجب في الإدخالات بمحلول الجسم المضاد (100 ميكرولتر) ، واحتضان العينات في غرفة مرطبة.
      ملاحظة: اضبط الوقت ودرجة الحرارة لكل حضانة باستخدام الجسم المضاد الأساسي. المعلمات النموذجية هي 2 ساعة في RT أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  4. اغسل العينات لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام PBST.
    1. بالنسبة للخلايا الموجودة على أغطية ، انقلها إلى صفيحة مكونة من 12 بئرا وأضف محلول PBST.
    2. بالنسبة لمزارع الوذمة الوعائية الوراثية، استبدل محلول الجسم المضاد بمحلول PBST.
  5. تحقق من مصادر الضوء والمرشحات المتاحة للمجهر متحد البؤر.
  6. اختر الأجسام المضادة الثانوية وفقا للأنواع المضيفة. اختر معلمات الفلوروفور (الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث ، وعرض الطيف ، وكفاءة الإثارة وفقا لمصدر الضوء المتاح).
    ملاحظه: يمكن نمذجة المعلمات الطيفية باستخدام أدوات عبر الإنترنت (انظر جدول المواد).
  7. قم بإعداد محاليل الأجسام المضادة الثانوية المناسبة عن طريق تخفيفها بمحلول مانع.
  8. احتضان بالأجسام المضادة الثانوية (كما في 6.3) ، ولكن احتضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
  9. اغسل العينات كما في الخطوة 3.4.
  10. تلطيخ نووي وتركيب منزلق
    1. للخلايا الموجودة على أغطية
      1. استنشق PBST ، واستبدله ب DAPI (0.2 ميكروغرام / مل) في محلول 1x PBS.
      2. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في RT في الظلام.
      3. استنشق محلول DAPI ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام 1x PBS.
      4. ضع الغطاء على قطرات من 10 ميكرولتر من وسط التثبيت بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل.
      5. ختم الأغطية بطلاء الأظافر.
    2. لثقافات الوذمة الوعائية الوعائية
      1. استنشق 1x PBST ، واستبدله ب DAPI (0.2 ميكروغرام / مل) في محلول 1x PBS.
      2. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في RT في الظلام.
      3. استنشق محلول DAPI ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام 1x PBS.
      4. ضع الأغشية المقطوعة على قطرات من 10 ميكرولتر من وسط التركيب بحيث تكون الخلايا متجهة لأعلى ، وأضف وسيطا إضافيا (5 ميكرولتر) إلى الغشاء.
      5. قم بتغطية الأغشية بأغطية.
      6. ختم الأغطية بطلاء الأظافر.
< p class = "jove_title" >4. الفحص المجهري متحد البؤر

  1. حدد المسارات عن طريق تحديد الفلوروفورات المستخدمة.
  2. اختر وضع المسح وسرعة.
  3. اضبط قيم قوة الليزر والكسب والإزاحة لكل فلوروفور من خلال مقارنتها بعناصر التحكم السلبية المعنية: للفيروسات ، والخلايا المصابة بالصخور ؛ للبروتينات الخلوية ، والعينات الملطخة بالأجسام المضادة للتحكم في النمط المتماثل من مضيف مناسب.
  4. للحصول على صورة ثلاثية الأبعاد ، قم بتنشيط وضع z-stack ، وقم بتعيين الحدود الأعلى والسفلية. اضبط حجم الخطوة/رقمها.
    ملاحظه: لمزيد من التفاصيل حول تصوير فيروس كورونا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات معدات مجهر متحد البؤر LSM 880 زييس حاضنة Galaxy170R نيو برونزويك CO170R-230-1000 المواد 15 مم × 15 مم أغطية رقم 1 لابسولوت 7695022 أنابيب 1.5 مل فلوريدا الطبية 5.350.023.053 طبق 12 بئر TTP 92412 Alexa fluorophore 488-الأجسام المضادة الثانوية المترافقة إنفيتروجين β5-توبولين سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية ع ع - 134234 دابي الترمو: العلمية د1306 عازلة تضخيم HCR الأدوات الجزيئية ، Inc BAM01522 يمكن أيضا إعداد المخزن المؤقت doi:10.1242/dev.165753: معلومات تكميلية مكبر للصوت HCR B1-h1 Alexa Fluor 647 الأدوات الجزيئية ، وشركة S013922 مكبر للصوت HCR B1-h2 Alexa Fluor 647 الأدوات الجزيئية ، وشركة S012522 HCR مسبار التهجين عازلة الأدوات الجزيئية ، وشركة BPH03821 يمكن أيضا إعداد المخزن المؤقت doi:10.1242/dev.165753: معلومات تكميلية مجموعة مسبار HCR ل SARS-CoV-2 Ncapsid الأدوات الجزيئية ، وشركة ما قبل 134 HCR مسبار غسل العازلة الأدوات الجزيئية ، وشركة BPW01522 يمكن أيضا إعداد المخزن المؤقت doi:10.1242/dev.165753: معلومات تكميلية مطياف التألق نمذجة المعلمات الطيفية إيمج جي فيجي الحصول على صور z-stack ومعالجتها التألق المناعي (IF) حظر (1٪ BSA في PBST) 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية حضانة الأجسام المضادة الأولية (محلول الأجسام المضادة لتركيز أبروبريات في محلول حجب ) 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة / بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ، 30-50 ميكرولتر (محلول الجسم المضاد لتركيز أبروبريات في محلول الحظر) 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة / بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ، 100 ميكرولتر غسل الأجسام المضادة الأولية (PBST) 3 × 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة حضانة الأجسام المضادة الثانوية (محلول الأجسام المضادة لتركيز الخصائص في محلول المنع) 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 30-50 ميكرولتر (محلول الجسم المضاد بتركيز مناسب في محلول الحظر) 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 100 ميكرولتر غسل الأجسام المضادة الثانوية (PBST) 3 × 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة تلطيخ نووي (محلول DAPI) 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم 2 × 5 دقائق مع 1x PBS

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SARS CoV 2 RNA RNA Vero HCR DAPI

مقالات ذات صلة