يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

اختبار تحييد دقيق لقياس عيار الأجسام المضادة المعادلة في المصل البشري

2.1K مشاهدات

⸱

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

المصدر: Gross, F. L. et al., قياس استجابات الأجسام المضادة المعادلة للأنفلونزا لفيروسات A(H3N2) في الأمصال البشرية عن طريق فحوصات التحييد الدقيق باستخدام خلايا MDCK-SIAT1. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو فحوصات التحييد الدقيق لقياس تحييد الأجسام المضادة باستخدام خلايا الكلى Madin-Darby التي تفرط في التعبير عن حمض السياليك المرتبط بα2،6 في المصل البشري. غالبا ما يستخدم هذا الاختبار في علم الأمصال البشرية للأنفلونزا

البروتوكول

يجب التعامل مع جميع فيروسات الأنفلونزا وفقا لمتطلبات مستوى السلامة البيولوجية المناسبة (BSL-2 أو أعلى) على النحو المحدد في السلامة البيولوجية في المختبرات الميكروبيولوجية والطبية الحيوية (BMBL).

< p class = "jove_title" >1. تحضير الكواشف والمواد الأولية
  1. تحضير خلايا Madine Darby Canine-α2،6-sial transferase (MDCK-SIAT1) ووسط زراعة الخلايا المعقمة
    1. تحضير وسط زراعة الخلايا MDCK-SIAT1 باستخدام 500 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع نسبة عالية من الجلوكوز ، و 10٪ v/v مصل الأبقار الجنينية المعطل بالحرارة (FBS) ، و 2 ملي لتر من الجلوتامين ، و 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 1 مجم / مل كبريتات G418 (على سبيل المثال ، الوراثة) ، و 100 وحدة / مل بنسلين مع 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (اختياري). تعقيم عن طريق الترشيح من خلال غشاء بحجم المسام 0.2 ميكرومتر. تضاف كبريتات G418 لضمان استقرار البلازميد في خلايا MDCK-SIAT1.
    2. قم بإعداد خط الخلايا MDCK-SIAT1. في قارورة (قوارير) زراعة الأنسجة مقاس 162 سم2 تحتوي على 30 مل من وسائط زراعة الخلايا المعقمة ، قوارير البذور مع 2 - 2.5 × 106 خلايا MDCK-SIAT1 وتحتضن عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 لمدة يومين ؛ سيتم استخدام هذا لتحديد الجرعة المعدية لزراعة الأنسجة (TCID) ومقايسات MN.
      ملاحظه: تم توفير خلايا MDCK-SIAT1 من قبل الدكتور م. ماتروسوفيتش ، ماربورغ ، ألمانيا. يمكن أيضا الحصول على خط الخلية هذا تجاريا (انظر جدول المواد).
  2. تحضير وسائط انتشار الفيروس المعقمة باستخدام 500 مل من الجلوكوز العالي DMEM، وجزء الألبومين في مصل الأبقار (BSA) بنسبة 0.3٪، و100 واحد/مل من البنسلين، و100 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين، و20 ملي مولار N-2-هيدروكسي إيثيل بيبرازين-N'-2-حمض إيثان سلفونيك (HEPES). تعقيم عن طريق الترشيح من خلال غشاء بحجم المسام 0.2 ميكرومتر.
  3. تحضير 0.75٪ (v / v) خلايا الدم الحمراء لخنزير غينيا (gpRBCs) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 0.01 M PBS ، عند درجة الحموضة 7.2.
  4. تحضير مخفف الفيروس المعقم باستخدام نسبة الجلوكوز العالية DMEM، وجزء الألبومين البقري الخامس (BSA) بنسبة 1٪، و100 واحد/مل من البنسلين، و100 ميكروغرام/مل من الستربتومايسين، و20 ملي مولار HEPES. تعقيم عن طريق الترشيح بغشاء بحجم المسام 0.2 ميكرومتر وقم بإعداده طازجا لكل فحص.
  5. قم بإعداد مثبت الخلايا الباردة على أنه 80٪ أسيتون بارد في PBS (0.01 M PBS ، درجة الحموضة 7.2).
  6. قم بإعداد المخزن المؤقت للغسيل باستخدام PBS (0.01 M PBS pH 7.2) و 0.3٪ (حجم / حجم) بين 20.
  7. تحضير مخفف الجسم المضاد باستخدام PBS (0.01 M PBS ، درجة الحموضة 7.2) ، 0.3٪ (حجم / حجم) بين 20 ، و 5٪ حليب جاف خالي الدسم.
  8. استخدم استنساخ الأجسام المضادة أحادية النسيلة للفأر المضادة المضادة للأنفلونزا A NP A1 و A3 كجسم مضاد أساسي. يخفف في مخفف الجسم المضاد بالتركيز الأمثل كما هو محدد عن طريق المعايرة.
  9. استخدم IgG مضاد للفأر من الماعز مترافق مع بيروكسيداز فجل الحصان (HRP) كجسم مضاد ثانوي. يخفف في مخفف الجسم المضاد بالتركيز الأمثل كما هو محدد عن طريق المعايرة.
  10. تحضير ركيزة البيروكسيديز باستخدام o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD) في 0.05 M citrate citrate buffer عند الرقم الهيدروجيني 5. تحضير عازلة سترات الفوسفات 0.05 M عن طريق إذابة 1 كبسولة / 100 مل منزوعة الأيونات H2O. قم بإذابة 1 قرص عيادات الخارجية (10 مجم) / 20 مل من مخزن سترات الفوسفات قبل الاستخدام مباشرة.
  11. استخدم 0.5 متر من حمض الكبريتيك كمحلول إيقاف العيادات الخارجية. أضف 28 مل من مخزون حمض الكبريتيك 18 مليونا إلى 972 مل من H2O منزوع الأيونات في غطاء كيميائي.
  12. علاج الأمصال البشرية والحيوانية
    1. قم بتعطيل الأمصال البشرية المستخدمة في فحوصات MN بالحرارة في حمام مائي عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الفحص. استخدم على الفور أو إذا لزم الأمر ، قم بتخزين الأمصال المذابة عند 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 24 ساعة ؛ إذا كانت هناك حاجة إلى فترة تخزين أطول ، فقم بتخزين الأمصال المجمدة عند -20 درجة مئوية أو أكثر برودة.
    2. عالج الأمصال الحيوانية المستخدمة في فحوصات MN باستخدام إنزيم تدمير المستقبلات (RDE) وتعطيل الحرارة قبل الفحص على النحو التالي.
      1. قم بإذابة الأمصال في حمام مائي 37 درجة مئوية ثم ضعها على الثلج. امزج 1 حجم من عينة مصل مع 3 أحجام من RDE. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 18-20 ساعة.
        2. قم
      2. بتعطيل الحرارة السيل المعالج ب RDE عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أضف 6 أحجام من PBS ، درجة الحموضة 7.2 إلى كل عينة للتخفيف المسبق النهائي بنسبة 1:10. إذا لزم الأمر ، قم بتخزين الأمصال المذابة عند 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 24 ساعة ؛ إذا كانت هناك حاجة إلى فترة تخزين أطول ، قم بتخزين الأمصال المجمدة عند -20 درجة مئوية أو أكثر برودة.
        ملاحظه: قد تحتوي الأمصال الحيوانية على العديد من جليكان حمض السياليك التي قد ترتبط بالهيماجلوتينين ، أو HAs لفيروسات الأنفلونزا وتمنع ارتباط الأجسام المضادة للأنفسان الهيالورونالويكية الخاصة بالإنفلونزا. لذلك ، من الضروري معالجة RDE لجميع الأمصال الحيوانية قبل فحوصات MN لإزالة روابط HA الفيروسية غير المحددة في عينات المصل.
< p class = "jove_title" >2. مرور ثقافة الخلايا MDCK-SIAT1

ملاحظة: يجب إجراء جميع مزارع الخلايا في خزانة السلامة البيولوجية لمنع التلوث.

  1. صب وسط زراعة الخلية من طبقة أحادية الخلية في قوارير 162 سم2. قم بتربسين الخلايا عن طريق شطف الطبقة الأحادية بحمض رباعي الأسيتيك التربسين - إيثيلين ديامين (EDTA). أضف 5 مل من التربسين EDTA لتغطية طبقة أحادية الخلية. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، ثاني أكسيد الكربون2 حتى تنفصل الطبقة الأحادية (5-10 دقائق). أضف 15 مل من وسائط زراعة الخلايا MDCK-SIAT1 إلى كل قارورة تحتوي على خلايا تربسينية ، وقم بالماصة لأعلى ولأسفل لفصل الخلايا.
  2. استخدم مقياس كثافة الدم والتريبان الأزرق لتحديد عدد الخلايا وقابليتها للحياة. قم بزرع الخلايا في قوارير جديدة لزراعة الأنسجة مقاس 162 سم2 تحتوي على 30 مل من وسائط زراعة الخلايا مع 2-2.5 × 106 خلايا / قارورة وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة يومين لاستخدامها في فحوصات TCID و MN. خلايا البذور في 4-5 × 106 خلايا / قارورة وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة يومين لاستخدامها في تكاثر الفيروسات.
    ملاحظه: يمكن تعديل كثافة البذر إذا كانت هناك رغبة في فترات استزراع أقصر أو أطول. لانتشار الفيروس ، يجب أن تصل الخلايا إلى أكثر من 100٪ من التقاء. بالنسبة لجرعة عدوى زراعة الأنسجة (TCID) وفحوصات MN ، يجب أن تكون الخلايا عند التقاء 75-95٪ (الشكل 1).
< p class = "jove_title" >3. انتشار فيروسات A (H3N2) في خلايا MDCK-SIAT1

ملاحظة: يمكن أن ينتشر فيروس A (H3N2) إما في بيض الدجاج المجنم البالغ من العمر 10-11 يوما وفقا للبروتوكول القياسي ، أو مزارع الخلايا MDCK-SIAT1. يجب أن تصل خلايا MDCK-SIAT1 إلى أكثر من 100٪ من التقاء الفيروس. يمكن تلقيح مخزونات بذور الفيروس بتخفيفات متعددة من اللقاح. يمكن استخدام تخفيفات اللقاح مع أفضل حمض الهيالورونيك للحصاد والعدوى لمزيد من فحوصات MN.

  1. قم بإزالة وسط زراعة الخلية من طبقة الخلية الأحادية (التقاء >100٪) في قوارير 162 سم2. اغسل الطبقة الأحادية مرتين ب 15 مل من معقم 0.01 M PBS ، ودرجة الحموضة 7.2 ، والصبر.
  2. قم بتسمية قارورة 1 كعنصر تحكم وأضف 20 مل من وسائط انتشار الفيروس. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. اترك هذه القارورة كما هي واستخدمها للمقارنة بعد اليوم الأول من انتشار الفيروس.
  3. أضف 10 مل من وسائط انتشار الفيروس المعقمة إلى القوارير (القوارير) واحتضان جميع القوارير (القوارير) عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. قم بإذابة قارورة من مخزون فيروس الأنفلونزا في درجة حرارة الغرفة ثم ضعها على الثلج. تمييع بوسائط انتشار الفيروس إلى التخفيفات المستهدفة.
    ملاحظه: يمكن تعديل التخفيفات المستهدفة بناء على عيار HA لمخزونات الفيروسات. لتحضير لقاح مخفف 1: 1000 ، أضف 100 ميكرولتر من الفيروس إلى 9.9 مل من وسائط انتشار الفيروس المعقمة. اقلبها برفق ، وقم بإزالة 1 مل من التخفيف 1: 100 إلى 9 مل من وسائط انتشار الفيروس المعقمة واقلبها برفق للحصول على لقاح مخفف 1: 1000. ضعها على الثلج.
  4. قم بإزالة جميع القوارير باستثناء قارورة التحكم من الحاضنة. قم بإزالة وسائط انتشار الفيروس من قارورة (قارورات) خلايا MDCK-SIAT1 وتلقيح كل قارورة ب 10 مل من الفيروس المخفف. احتضن القوارير عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة ساعة واحدة ، مع تدوير القوارير (القوارير) كل 15 دقيقة.
  5. قم بإزالة 5 مل من اللقاح من القارورة (القارورة) واستبدلها ب 15 مل من وسائط انتشار الفيروس التي تحتوي على 1 ميكروغرام / مل توسيل فينيل ألانيل كلورو ميثيل الكيتون التربسين (TPCK-trypsin). احتضان القوارير (القوارير) عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 16-18 ساعة.
  6. بعد الحضانة الليلية ، راقب القارورة (القوارير) تحت تكبير المجهر 100X وابحث عن تأثيرات الاعتلال الخلوي (CPE) على الخلايا. قم بإزالة 15-17 مل من المادة الطافية للفيروس من القارورة (القوارير) ، واستبدلها ب 15-17 مل من وسائط انتشار الفيروس المعدة حديثا والتي تحتوي على 2 ميكروغرام / مل TPCK-trypsin.
  7. احتضان القوارير عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. راقب CPE أحادي الطبقة (بالمقارنة مع قارورة التحكم في الخلية) وتحقق من HA بشكل دوري (كل 4 ساعات) باستخدام 0.75٪ gpRBC حتى الحصاد.
    1. قم بإعداد لوحة ميكروتيتر HA 96 بئر. أضف 50 ميكرولتر من 0.01 M PBS ، ودرجة الحموضة 7.2 إلى الآبار A2 - A12 و B2 - B12 (مكررات) ، والآبار H1 - H12 للتحكم.
    2. أضف 100 ميكرولتر من المادة الطافية للفيروس إلى A1 و A2 ، وقم بإجراء تخفيف تسلسلي 2 ضعفا من A1 و B1 إلى A12 و B12. تخلص من 50 ميكرولتر بعد الخلط في A12 و B12. أضف 50 ميكرولتر من 0.75٪ gpRBCs إلى الصفوف A و B و H.
    3. اضغط على الطبق واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
      1. تحديد HA للطافي الطافي للفيروس عن طريق إمالة صفيحة الميكروتيتر المكونة من 96 بئرا بزاوية 45 درجة إلى 60 درجة.
      2. قراءة لوحات التضخم الدموي ؛ يعتبر أعلى تخفيف للفيروس الذي يحقق تضخم الدم الكامل نقطة نهاية معايرة HA للفيروس المحدد. سجل متبادلة أعلى تخفيف للفيروس مع تضخم الدم الكامل كعيار HA للفيروس.
        ملاحظه: يجب أن تبدأ كرات الدم الحمراء المستقرة في الصف H (عناصر التحكم) في "الجري" وتشكل شكل دمعة صغيرة بسبب الجاذبية. انتظر حتى تنتهي كرات الدم الحمراء في آبار التحكم من العمل ، ثم اقرأ أزرار كرات الدم الحمراء في آبار معايرة الفيروس. تلك التي تظهر أزرار كرات الدم الحمراء و "تشغيلها" ، لا تحقق تضخم الدم. حدد أعلى تخفيف للفيروس الذي يثبط تماما تضخم الدم باعتباره عيار HA النقطي للفيروس.
  8. حصاد الفيروس عندما تهضب HA لزراعة الفيروس أو تصل مزرعة الفيروس إلى HA المستهدف (على سبيل المثال ، >16 وحدة HA) ، ولكن قبل أن تبدأ الطبقة الأحادية للخلية في إظهار CPE كبير.
    1. الطرد المركزي للطافية لزراعة الفيروس عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات الحطام الخلوي. انقل المادة الطافية المصفاة التي تحتوي على حصاد الفيروس إلى أنبوب نظيف. حصاد المادة الطافية التي تحتوي على الفيروس في قوارير مبردة معقمة تستخدم لمرة واحدة وتجميدها على الفور عند -70 درجة مئوية أو أكثر برودة. < / > ملاحظه: يجب أن تحتوي مخزونات الفيروسات المستخدمة في فحوصات MN على عيار معدي مرتفع وجزيئات معيبة ضئيلة. الحد الأدنى لتخفيف مخزونات الفيروسات لتحقيق 100 TCID50/50 ميكرولتر لمقايسة MN هو 1: 100. < / > ملاحظه: لا ينبغي إذابة مخزونات الفيروسات المستخدمة في فحوصات MN وإعادة تجميدها.
< p class = "jove_title" >4. تحديد TCID للفيروس
  1. اليوم 1: معايرة الفيروس
    1. قم بإذابة قارورة من الفيروس في درجة حرارة الغرفة وضعها على الفور على الجليد.
    2. اختبر الفيروس في تخفيفين مختلفين للبدء: 10-2 و 10-3. أضف 100 ميكرولتر من الفيروس إلى 9.9 مل من مخفف الفيروس للتخفيف 10-2. أضف 1 مل من 10-2 تخفيف إلى 9.0 مل من مخفف الفيروس لمدة 10-3 تخفيف.
    3. باستخدام لوحين ميكروتيتر (اللوحة 1 للتخفيف 10-2 واللوحة 2 للتخفيف 10-3) ، أضف 100 ميكرولتر من مخفف الفيروس إلى جميع الآبار باستثناء العمود 1 من صفيحة الميكروتيتر المكونة من 96 بئر.
    4. قم بإجراء 1/2log10 تخفيفات (10-2 ، 10-2.5 ، 10-3 ، إلخ). أضف 146 ميكرولتر من بدء تخفيف الفيروس إلى جميع الآبار في العمود 1 وانقل 46 ميكرولتر بشكل متسلسل من العمود 1 إلى العمود 11 (الشكل 2). قم بتغيير أطراف الماصة بين الآبار. بعد خلط العمود 11 ، تخلص من الأطراف مع تخفيف 46 ميكرولتر.
    5. استخدم العمود 12 كعنصر تحكم في الخلية (CC) ؛ يحتوي فقط على مخفف للفيروسات. احتضان لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  2. اليوم 1: تحضير خلايا MDCK-SIAT1
    ملاحظه: يجب أن تصل الطبقة الأحادية للخلية MDCK-SIAT1 إلى 75-95٪ من التقاء فحوصات TCID و MN. يجب أن تنتج قارورة واحدة مقاس 162 سم2 عند التقاء 95٪ خلايا كافية لزرع ~ 4-5 ألواح ميكروتيتر.
    1. اغسل الطبقة الأحادية المتجمعة بنسبة 75 - 95٪ مع 20 مل PBS لإزالة FBS في وسائط الاستزراع. قم بتربسين الخلايا على النحو التالي.
      1. اشطف الطبقة الأحادية باستخدام PBS معقم ، وأضف 7 مل من التربسين EDTA لتغطية طبقة الخلية الأحادية. ضع القارورة بشكل مسطح واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى تنفصل الطبقة الأحادية (حوالي 5-10 دقائق). أضف 7 مل من مخفف الفيروس إلى كل قارورة تحتوي على الخلايا المدرجة في التربسين.
    2. اغسل الخلايا بمخفف الفيروس لإزالة FBS.
      1. مرر الماصة برفق لأعلى ولأسفل لفصل الخلايا. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل ؛ املأ الأنبوب بمخفف الفيروسات.
      2. جهاز طرد مركزي عند 485 × جم لمدة 5 دقائق. صب مخفف الفيروس ، واستبدله بمخفف فيروس جديد سعة 50 مل ، وجهاز طرد مركزي عند 485 × جم لمدة 5 دقائق.
    3. استخدم مقياس كثافة الدم والتريبان الأزرق لتحديد عدد الخلايا وقابليتها للحياة. اضبط تركيز الخلية باستخدام مخفف الفيروس إلى 1.5 × 105 خلايا / مل.
    4. أضف 100 ميكرولتر من خلايا MDCK-SIAT1 المخففة إلى كل بئر من ألواح الميكروتيتر (1.5 × 104 خلايا / بئر) وقم بتغطية الألواح. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 18-20 ساعة.
  3. اليوم 2: ELISA
    1. تثبيت الخلايا
      1. قم بإزالة الوسيط من ألواح الميكروتيتر. اغسل كل بئر ب 200 ميكرولتر من PBS. أضف 300 ميكرولتر من الأسيتون البارد 80٪ إلى كل بئر واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المثبت واترك الألواح تجف في الهواء.
    2. اليسا
      1. إضافة الأجسام المضادة الأولية
        ملاحظه: يجب استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد للأنفلونزا A NP بشكل زائد كجسم مضاد أساسي في ELISA. تحديد التخفيف الأمثل للأجسام المضادة لكل مجموعة من الأجسام المضادة الأولية عن طريق إجراء معايرة الأجسام المضادة في MN. حدد تركيز الجسم المضاد الأساسي الزائد والأفضل نسبة إشارة إلى خلفية.
        1. تمييع الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد للأنفلونزا A NP (الجسم المضاد الأولي) إلى التركيز المستهدف في مخفف الجسم المضاد (على سبيل المثال ، أضف 30 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي إلى 30 مل من مخفف الجسم المضاد للتخفيف المستهدف 1: 1000).
        2. اغسل الأطباق 3 مرات بسعة 300 ميكرولتر من محلول الغسيل. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف إلى كل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
      2. إضافة الأجسام المضادة الثانوية
        ملاحظة: يجب استخدام الغلوبولين المناعي المضاد للفأر للماعز ، IgG المترافق مع بيروكسيداز فجل الحصان (HRP) بشكل زائد كجسم مضاد ثانوي في ELISA. تحديد التخفيف الأمثل للأجسام المضادة لكل مجموعة من الأجسام المضادة الثانوية عن طريق إجراء معايرة الأجسام المضادة. حدد تركيز الجسم المضاد الثانوي الزائد وبأفضل نسبة إشارة إلى خلفية.
        1. تمييع الماعز المضاد للفأر IgG المترافق مع الجسم المضاد HRP (الجسم المضاد الثانوي) إلى التركيز المستهدف في مخفف الجسم المضاد (على سبيل المثال ، أضف 7.5 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي إلى 30 مل من مخفف الجسم المضاد للتخفيف المستهدف 1: 4000).
        2. اغسل الأطباق 3 مرات باستخدام مخزن غسيل 300 ميكرولتر. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف إلى كل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
      3. إضافة الركيزة وقراءة اللوحة
        1. اغسل الأطباق 5 مرات باستخدام مخزن غسيل 300 ميكرولتر واضغط على منديل خال من النسالة.
        2. أضف 100 ميكرولتر من الركيزة المحضرة حديثا إلى كل بئر واحتضانها في درجة حرارة الغرفة حتى يتشبع تطور اللون والكثافة الضوئية (OD) لآبار التحكم في الخلية <0.2.
        3. أضف 100 ميكرولتر من محلول التوقف إلى جميع الآبار. اقرأ OD للآبار عند 490 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي الدقيق.
  4. حساب TCID 50
    1. احسب متوسط OD490 لعناصر التحكم في الخلية (العمود 12).
    2. واعتبر أي بئر اختبار مع OD490 أكبر من ضعف متوسط OD490 لآبار CC على أنه "إيجابي"؛ وإلا فإنه يعتبر "سلبيا".
    3. احسب TCID50 للفيروس باستخدام طريقة Reed-Muench.
      1. حدد عدد الإيجابيات والسلبيات في كل تخفيف.
      2. احسب "الإيجابي التراكمي" و "السلبي التراكمي" و "النسبة" و "النسبة المئوية الإيجابية" كما هو موضح في الجدول 1.
      3. احسب "المسافة المتناسبة" بين التخفيف الذي يظهر >50٪ إيجابيات والتخفيف الذي يظهر <50٪ إيجابيا باستخدام ما يلي:
        figure-protocol-1
        ملاحظه: عامل التصحيح لتخفيف 1/2 لوغاريتمي هو 0.5. على سبيل المثال ، في الجدول 1: (80 - 50) / (80 − 20) x 0.5 = 0.25
      4. احسب الفيروس TCID50 عن طريق إضافة المسافة النسبية إلى التخفيف الذي يظهر > 50٪ إيجابي.
        >ملاحظه: على سبيل المثال ، في الجدول 2 ، TCID50 هو 10-5 + (-0.25) = 10-5.25. ملاحظة: هذا هو TCID50 للفيروس لكل 100 ميكرولتر (أو 10-5.25 / 100 ميكرولتر).
    4. احسب تخفيف الفيروس. بالنسبة لمقايسات MN ، قم بتخفيف الفيروس إلى 200 TCID50/100 ميكرولتر (أي ما يعادل 100 TCID50/50 ميكرولتر لكل بئر).
      ملاحظه: في المثال الوارد في الجدول 1 ، 1 TCID50 هو 10-5.25 في 100 ميكرولتر ، والتخفيف لتحقيق 200 TCID50/100 ميكرولتر هو 1: 891 بناء على الحسابات: 200 × 10-5.25 = 10-2.95 = 1/102.95 = 1/891

5. فحص MN باستخدام خلايا MDCK-SIAT1

  1. اليوم 1: اختبار ومراقبة إعداد المصل وتخطيط اللوحة
    1. قم بإذابة المصل في حمام مائي 37 درجة مئوية وقم بإزالته مباشرة بعد الذوبان. Aliquot كمية الأمصال التي تحتاج إلى اختبار; هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 10 ميكرولتر من الأمصال الأصلية للاختبار بفيروس واحد في واحد. اختبار المصل في نسخ مكررة إن أمكن.
    2. الحرارة تعطيل المصل البشري لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 56 درجة مئوية كما في الخطوة 1.12.1. ضع المصل على الثلج بعد تعطيل الحرارة ، وأضف مخفف الفيروس إلى الأمصال لتحقيق التخفيف المسبق بنسبة 1:10.
    3. معالجة RDE وتخفيف مصل مسبقا إلى 1:10 لاستخدامها للعناصر الضابطة لكل 1.12.2.
      ملاحظه: يمكن تخزين الأمصال البشرية والحيوانية المذابة والمعالجة عند 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 24 ساعة. يجب تخزين السيرا مجمدة عند -20 درجة مئوية أو أكثر برودة إذا كانت هناك حاجة إلى فترة تخزين أطول قبل الفحص.
    4. للاختبار مع فيروس واحد ، أضف 100 ميكرولتر 1:10 مصل مخفف إلى الأعمدة A1 إلى A10 (الشكل 3). أضف 50 ميكرولتر من مخفف الفيروس إلى الصفوف B إلى H ، باستثناء العمودين 11 و 12 (الشكل 3). قم بإجراء تخفيف تسلسلي 2 أضعاف من الصفوف A إلى H ، وتخلص من آخر 50 ميكرولتر في الصف H (الشكل 3).
      ملاحظه: عندما يتم اختبار فيروسات متعددة ، يمكن تخفيف الأمصال في أنابيب العيار. تخفيف المصل ، لتحديد عيار المصل ، في البئر A هو 1:10 ، البئر B 1:20 ، البئر C 1:40 ، البئر D 1: 80 ، البئر E 1: 160 ، البئر F 1: 320 ، البئر G 1: 640 ، البئر H 1: 1،280 (الشكل 3).
    5. لمكافحة الفيروس ، أضف 50 ميكرولتر من مخفف الفيروس إلى الآبار A12 و B12 و C12 و D12 (بدون سيرا). للتحكم في الخلية ، أضف 100 ميكرولتر من مخفف الفيروس إلى الآبار E12 و F12 و G12 و H12 (بدون فيروس ، لا سيرا).
    6. بالنسبة لأمصال التحكم (على سبيل المثال ، ضوابط مصل النمس) ، أضف 100 ميكرولتر من مصل التحكم المخفف إلى العمود A البئر 11 وأضف 50 ميكرولتر من مخفف الفيروس إلى الآبار B11 - H11. تخفيف تسلسلي.
    7. غطي الأطباق واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى تصبح جاهزة لإضافة الفيروس.
  2. اليوم 1: إضافة الفيروسات
    1. تمييع الفيروس إلى 100 TCID50/50 ميكرولتر مع مخفف الفيروس.
    2. أضف 50 ميكرولتر من الفيروس المخفف إلى جميع الآبار، باستثناء العمود 11 على ألواح المعايرة بالتحليل الحجمي الخلفي (BT) وآبار التحكم في الخلايا E12 وF12 وG12 وH12 على جميع الألواح (الشكل 3). بالنسبة لتلك الصفائح التي تحتوي على مصل التحكم في العمود 11 ، أضف الفيروس إلى العمود 11.
    3. المعايرة بالتحليل الحجمي الخلفي (BT)
      1. قم بتضمين BT في العمود 11 من مجموعة واحدة من اللوحات المكررة (على سبيل المثال ، اللوحات 1A و 1B). أضف 50 ميكرولتر من مخفف الفيروس إلى جميع الآبار في العمود 11. أضف 50 ميكرولتر من الفيروس عند 100 TCID50/50 ميكرولتر إلى البئر الأول (A11). امزج عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
      2. امزج وانقل 50 ميكرولتر إلى آبار متتالية لإجراء تخفيفات تسلسلية بضعفين. قم بتغيير أطراف الماصة بين الآبار لتجنب انتقال الفيروس. تخلص من 50 ميكرولتر من البئر H11.
      3. أضف 50 ميكرولتر من مخفف الفيروس إلى العمود 11 ليصل الحجم النهائي إلى 100 ميكرولتر. اضغط على الألواح للخلط.
    4. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 1 ساعة.
    5. إجراء إضافة خلايا MDCK-SIAT1 في اليوم 1 و ELISA في اليوم 2 كما هو موضح في الخطوتين 4.2 و 4.3 (موصوف أيضا في 5.3 و 5.4)
  3. اليوم 1: إضافة خلايا MDCK-SIAT1
    1. قم بإعداد خلايا MDCK-SIAT1 كما هو موضح في الخطوة 4.2. أضف 100 ميكرولتر من خلايا MDCK-SIAT1 عند 1.5 × 105 خلايا / مل لكل بئر (1.5 × 104 خلايا / بئر). احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 18-20 ساعة.
  4. اليوم 2: ELISA
    1. بعد الحضانة الليلية ، في اليوم الثاني ، قم بإصلاح الخلايا بنسبة 80٪ من الأسيتون البارد كما هو موضح في الخطوة 4.3.
    2. إضافة الأجسام المضادة الأولية
      1. اغسل الأطباق 3 مرات باستخدام مخزن غسيل 300 ميكرولتر. تمييع الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد للأنفلونزا A NP (الجسم المضاد الأولي) إلى التركيز الأمثل كما هو محدد عن طريق المعايرة بالتحليل الحجمي في مخفف الجسم المضاد (على سبيل المثال ، أضف 30 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي إلى 30 مل من مخفف الجسم المضاد للتخفيف المستهدف 1: 1000).
        ملاحظة: مطلوب 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي لكل بئر. ~ 10 مل مطلوب لكل لوحة.
      2. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف إلى كل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    3. إضافة الأجسام المضادة الثانوية
      1. اغسل الأطباق 3 مرات باستخدام محلول غسيل 300 ميكرولتر. قم بتخفيف IgG المضاد للفأر الماعز المترافق مع الجسم المضاد HRP (الجسم المضاد الثانوي) إلى التركيز المستهدف في مخفف الجسم المضاد (على سبيل المثال ، أضف 7.5 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي إلى 30 مل من مخفف الجسم المضاد للهدف 1: 4000.)< / > ملاحظة: مطلوب 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي لكل 96 بئر. ~ 10 مل مطلوب لكل لوحة.
      2. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف إلى كل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    4. إضافة الركيزة وقراءة اللوحة
      1. اغسل الأطباق 5 مرات باستخدام مخزن غسيل 300 ميكرولتر واضغط على المناديل الخالية من النسالة.
      2. أضف 100 ميكرولتر من الركيزة المعدة حديثا إلى كل بئر واحتضانها في درجة حرارة الغرفة حتى تصل آبار مكافحة الفيروس إلى OD490 = 0.8 - 3 ، مع التحكم في الخلية في خلفية منخفضة OD490 <0.2.
      3. أضف 100 ميكرولتر من محلول التوقف إلى جميع الآبار. اقرأ OD للآبار عند 490 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي الدقيق.
  5. تحليل البيانات
    ملاحظه: يتم تحديد حسابات MN لكل لوحة على حدة.
    1. تحديد عيار الأجسام المضادة المعادلة لكل عينة مصل.
      1. احسب قطع OD490 لتحييد الفيروس بنسبة 50٪ لكل لوحة باستخدام المعادلة التالية:
        figure-protocol-2
        ملاحظه: هنا x = 50٪ من قطع التحييد. يعتبر تخفيف المصل المتبادل المقابل لأعلى تخفيف مع OD490 أقل من 50٪ من القطع (تثبيط ≥50٪) عيار الجسم المضاد للتحييد لعينة المصل (الشكل 4).
    2. تأكد من أن آبار التحكم في الخلية تحتوي على OD490 <0.2 وأن آبار مكافحة الفيروسات لها OD490 = 0.8 - 3.
    3. تحقق من عدوى الفيروس في كل اختبار (100x TCID50) بواسطة الفيروس BT. النطاق المقبول ل BT هو 50 أو 100 أو 200 TCID. في حالة استخدام نفس القطع كما هو محدد في الخطوة 4.4.2 ، يجب أن يكون أعلى تخفيف للفيروس في عمود BT مع OD فوق القطع في الآبار E11 و F11 و G11.
      ملاحظه: يجب أن تعطي الضوابط الإيجابية في المصل عيار في حدود 2 أضعاف القيم التي تم الحصول عليها في الاختبارات السابقة. يجب أن يكون OD490 للتحكم السلبي في المصل مشابها لتلك التي لوحظت لمكافحة الفيروس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

figure-results-1
الشكل 1. مزرعة الخلايا MDCK-SIAT1. MDCK-SIAT1 cells. (أ) MDCK-SIAT1 أحادي الطبقة المتشابك (>التقاء 100٪) لتطعيم الفيروسات؛ (B) خلايا MDCK-SIAT1 في مرحلة السجل مع التقاء 75 - 95٪ لمقايسات TCID 50 و MN.

figure-results-2
الشكل 2....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع نسبة عالية من الجلوكوز علوم الحياة11965مكون حاسم لزراعة الخلايا المعقمة وانتشار الفيروسات والوسائط المخففة للفيروسات
مصل الجنين البقري (FBS)HycloneSH30070.03
ألبومين مصل البقر (BSA) الكسر الخامس ، خال من البروتازسيجما ألدريتش 3117332001
L-جلوتامين علوم الحياة25030-081
بيروفات الصوديومعلوم الحياة11360-070
ملح ثاني كبريتات Geneticin G-418 سيجما ألدريتش A1720-5G
هيبسعلوم الحياة15630-080
البنسلين / الستربتومايسين علوم الحياة15140-122
الأسيتونVWR67-64-1تستخدم بتركيز 80٪
عازلة الفوسفات والسترات مع بيربورات الصوديوم سيجما ألدريتش SLBF2806V
قرص O-Phenylenediamine ثنائي هيدروكلوريد سيجما ألدريتش SLBQ1086V 1 قرص لكل 100 مل من ماء زراعة الخلايا
حامض الكبريتيك فيشر العلميA510-P500يستخدم تركيز نهائي 0.5 متر
الإيثانول ، مشوهة ، 4 لتر VWREM-AX0422-3تستخدم بتركيز 70٪
التربسين EDTAعلوم الحياة1748048
RDE II "Seiken"Denka Seiken370013
توين 20سيجما ألدريتش P1379-500ml
ماوس أحادي النسيلة مضاد ل NP Abميليبور بركMAB 8257 MAB 8258
مكافحة الماوس IgG HRP KPL074-1802
96 بئر ألواح مسطحة القاع الحراري العلمي3455
قارئ اللوحةالجهاز الجزيئيSpectromax 384 plus
قارورة زراعة الخلية 162 سم 2 / غطاء تنفيس كورنينج / VWR3151

الوسوم

MDCK SIAT1 OPD
اختبار تحييد دقيق لقياس عيار الأجسام المضادة المعادلة في المصل البشري
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.