قياس تثبيط نمو الشتلات الناجم عن المناعة

الملخص

المصدر: Bredow، M. et al. ، فحوصات تثبيط نمو الشتلات وانفجار الأكسدة التي يسببها النمط في نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا. J. Vis. Exp. (147) ، (2019).

يوضح هذا الفيديو مقايسة تثبيط نمو الشتلات في نبات نبات ن يتم تحديد تأثير زيادة تركيز محفز الببتيد المناعي على نمو الشتلات.

البروتوكول

p class = "jove_title" >1. فحص تثبيط نمو الشتلات

1. تعقيم البذور وزرعها على ألواح Murashige و Skoog (MS).
   1. تحضير نصف قوة معقمة (0.5x) MS متوسطة (2.16 جم / لتر) تحتوي على 0.8٪ أجار [وزن / حجم]. صب الوسائط في أطباق (90 × 15 مم) في غطاء تدفق رقائقي.
   2. تعقيم ما يقرب من 100 بذرة في أنبوب طرد مركزي دقيق عن طريق الغسيل ب 1 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة دقيقتين وإزالته عن طريق الشفط. أضف 1 مل من المبيض بنسبة 40٪ وهز برفق لمدة 17 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المبيض عن طريق الشفط واغسله ثلاث مرات في 1 مل من الماء المعقم لمدة 5 دقائق. أعلق في 1 مل من أجار معقم 0.1٪ أجار.
      ملاحظه: بدلا من ذلك ، استخدم بروتوكول تعقيم بذور غاز الكلور 24.
   3. زرع ما يقرب من 100 بذرة لكل نمط جيني على ألواح أجار MS باستخدام ماصة وختم بشريط مسام دقيقة في غطاء التدفق الرقائقي.
      ملاحظه: تجنب وضع البذور على مقربة من بعضها البعض لأن ذلك سيجعل زرع الشتلات صعبا لاحقا.
   4. قم بتقسيم البذور إلى طبقات عن طريق وضع الألواح عند 4 درجات مئوية (بدون ضوء) لمدة 3-4 أيام لمزامنة الإنبات (الشكل 1 أ).
2. زرع الشتلات في 48 لوحة بئر تحتوي على ببتيدات محفزات مناعية.
   1. بعد التقسيم الطبقي ، انقل الألواح إلى الضوء في ظل ظروف يوم قصير (22 درجة مئوية ، وضوء 10 ساعات ، وشدة ضوء 150 ميكرو إيه / م² / ثانية ، ورطوبة نسبية 65-70٪) لمدة 3-4 أيام للسماح بالإنبات.
   2. في غطاء التدفق الصفحي ، قم بإعداد تخفيفات الببتيد المثير (0 نانومتر ، 1 نانومتر ، 10 نانومتر ، 100 نانومتر ، و 1,000 نانومتر) في وسائط سائلة معقمة 0.5x MS تحتوي على 1٪ سكروز [وزن / حجم] ، باستخدام 25 مل من MS لكل لوحة 48 بئرا. قم بإعداد الألواح عن طريق سحب 500 ميكرولتر من وسط MS السائل أو وسط MS الذي يحتوي على الببتيدات لكل بئر. إذا كان ذلك متاحا ، استخدم ماصة متكررة لإعداد اللوحة لتسريع العملية.
      ملاحظه: لكل نمط وراثي ، قم بزراعة الشتلات في MS بدون مستفز لحساب أي اختلافات متأصلة في نمو الشتلات.
   3. باستخدام ملقط معقم ، قم بزرع شتلة واحدة بعناية في كل بئر من نفس الحجم والعمر ، مما يضمن عدم وجود ضرر للشتلات أو كسر الجذر وأن الجذر مغمور في الوسائط. لكل نمط وراثي ، قم بزرع ما لا يقل عن 6-8 شتلات في كل تخفيف للببتيد (الشكل 1 ب).
      ملاحظه: زرع الشتلات بعد 4 أيام من الإنبات ، حيث يسهل التلاعب بالجذور القصيرة ، وقد تحقق الشتلات القديمة نتائج أقل مثالية.
   4. قم بختم الألواح بشريط صغير المسام والعودة إلى الضوء في ظل ظروف اليوم القصير القياسية (22 درجة مئوية ، وضوء 10 ساعات ، وشدة ضوء 150 ميكرو إيه / م² / ثانية ، ورطوبة نسبية 65-70٪). اترك الشتلات تنمو لمدة 8-12 يوما.

< p class = "jove_title" >2. تحديد نسبة تثبيط النمو.

1. قم بإزالة الشتلات بعناية من 48 طبقا جيدا وجففها عن طريق وضعها على منشفة ورقية. وزن الشتلات على مقياس تحليلي وسجل القيم. إذا كان ذلك متاحا، فاستخدم مقياسا تحليليا مزودا بمخرج USB لتسجيل قيم الوزن الجديدة على جدول بيانات. قبل وزن الشتلات ، التقط صورة لعرض تثبيط النمو بصريا (الشكل 1 ج).
2. تحديد نسبة تثبيط نمو الشتلات المعالجة بالملحق مقارنة بالشتلات المزروعة في MS فقط على النحو التالي:
   
3. ارسم البيانات باستخدام رسم بياني شريطي مع أشرطة خطأ قياسية أو باستخدام مربع ومخطط شعيرات لعرض التباين بين التجارب بشكل أفضل.

النتائج

الشكل 1. مقايسة تثبيط نمو الشتلات التي يسببها الإليسيتور في نبات الأرابيدوبسيس. (أ) زرع الشتلات على أجار MS وتنمو لمدة 3-4 أيام في ظل ظروف اليوم القصير القياسية. (ب) زرع الشتلات في 48 لوحة بئر تحتوي على وسط MS أو MS تحتوي على تركيزات مختلفة من elf18. (ج) بعد 8-12 يوما ، قم بتقييم حجم الشتلات بصريا ثم قم بقياس الوزن الطازج باستخدام مقياس تحليلي لتحديد النسبة المئوية لتثبيط النمو.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 8 أطباق معقمة بغطاء سيجما ألدريتش CLS3548 مقياس تحليلي مع مسودة شيد VWR VWR-225AC يمكن استخدام أي مقياس تحليلي قياسي لمقايسات بدء النمو ، ومع ذلك ، فإن إخراج الكمبيوتر المباشر هو الأمثل. BioHit mLine ميكانيكية متعددة القنوات 12 (30-300 ميكرولتر سارتوريوس 725240 يمكن استخدام أي ماصة متعددة القنوات، وكذلك ماصة واحدة إذا لزم الأمر. قزم 18 (AcSKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab [كب7211] قم بتخزين 10 ملي مولار من الببتيد عند -80 درجة مئوية في أنابيب ربط منخفضة البروتين. عند الذوبان ، قم بتخزين 100 ميكرومتر من المخزون عند -20 درجة مئوية. أملاح Murisage و Skoog القاعدية مختبرات Cedarlane MSP09-100LT يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. ألواح البوليسترين الأبيض 96 بئر فيشر ساينتيك 07-200-589