مقايسة للكشف عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في أنسجة الأرز عند الاستنباط المناعي

الملخص

المصدر: Wang، Y.، et al. الكشف في الوقت الفعلي عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الاستجابة المناعية في الأرز باستخدام فحص التلألؤ الكيميائي. J. Vis. إكسب. (2022).

يوضح هذا الفيديو فحصا للكشف في الوقت الفعلي عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في أنسجة الأرز عند استنباط النمط الجزيئي المرتبط بالعامل الممرض (PAMP). تتعرض أجزاء الغمد المقطوعة وأقراص الأوراق لببتيد مشتق من السوط البكتيري يعمل كPAMP. عند التعرف على الببتيد عبر مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) على الخلايا النباتية ، يحدث إنتاج سريع وعابر ل ROS ، والذي يتم اكتشافه عن طريق مقايسة التلألؤ الكيميائي.

البروتوكول

ملاحظة: ينطبق البروتوكول على الأنسجة النباتية المختلفة. تم استخدام غمد الأرز وأقراص الأوراق في هذا البروتوكول للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية عند استنباط PAMP. نظرا لأن الاختلافات تنشأ بشكل أساسي بسبب طريقة أخذ العينات ، يتم وصف الإجراءات الشائعة فقط أدناه ، مع ذكر خطوات محددة عند الضرورة.

فئة < ص = "jove_title" >1. تحضير الأنسجة ومعالجتها

1. غمد الأرز
   1. قم بتقطيع الغمد من شتلات الأرز التي يبلغ عمرها 10 أيام إلى شرائح 3 مم بشفرة حلاقة حادة أو شفرة جراحية للمعالجة المسبقة قبل يوم واحد من اختبار ROS (الشكل 1 ب).
   2. ضع خمسة أجزاء غمد في بئر فردي من صفيحة ميكروتيتر مكونة من 96 بئرا تحتوي على 100 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج (ddH₂O) لمدة 10-12 ساعة ، في الظلام عند 25 درجة مئوية ، مما يسمح بتخفيف التسرب الأيوني المرتبط بإصابة الجرح والاستجابات الدفاعية (الشكل 2).
      ملاحظه: يعد الحرص على الحفاظ على القطع عموديا لضمان مساحة سطح قطع متسقة معرضة لمحلول الاستنباط خطوة مهمة للحصول على نتائج قابلة للتكرار بدرجة كبيرة. حرك المقاطع برفق. لا تقم بعمل تخفيضات أو جروح إضافية على الأجزاء ، والتي قد تكون مصدرا لاختلاف البيانات. كمبدأ ، يجب أن يحتوي كل اختبار على خمس تكرارات على الأقل نظرا لأن تباين قيمة ROS كبير. كلما زاد عدد النسخ المتماثلة ، زادت موثوقية البيانات.
2. قرص الأوراق
   1. قطع أقراص الأوراق (قطرها 4 مم) من نباتات الأرز التي يبلغ عمرها 4-6 أسابيع باستخدام ثقب خزعة باستخدام مكبس. قم دائما بقص أقراص الأوراق من الثلث الأوسط من الورقة الثانية (مرقمة من الأعلى) للحارث الرئيسي لتقليل تباين البيانات (الشكل 1 ج).
   2. ضع قرصا ورقيا واحدا في بئر فردي من صفيحة ميكروتيتر مكونة من 96 بئرا تحتوي على 100 ميكرولتر من ddH₂O لمدة 10-12 ساعة للمعالجة المسبقة ، مما يسمح للاستجابات المتعلقة بالجرح بالتخفيف لأنها يمكن أن تتداخل مع تحريض ROS بواسطة PAMPs (الشكل 2).
      ملاحظه: قم بتشغيل أقراص الأوراق برفق. لا تقم بعمل جروح أو جروح إضافية على الأقراص في التجربة ، مما قد يؤدي إلى اختلاف البيانات. يحدث تحريض ROS في الغالب من خلايا الحافة المقطوعة ، حيث أن أسطح أنسجة الأرز (الأوراق أو الأغماد) مغطاة بطبقات كارهة للماء. فقط خلايا الحواف المقطوعة على اتصال بمحلول الاستنباط (راجع قسم المناقشة).
   3. حافظ على جميع أقراص الأوراق عائمة ، بحيث يكون السطح العاكس متجها لأعلى ، في آبار صفيحة ميكروتيتر للمعالجة المسبقة للمياه لتجنب التباين المرتبط بجانب الأوراق.

2. تحضير محلول الاستنباط

1. قم بإذابة مسحوق L-012 في محلول مائي 20 ملم (6.23 مجم / مل) مع ddH₂O لعمل محلول المخزون. بعد ذلك ، قم بتخفيف محلول المخزون بمحلول 50 ملي مولار Tris HCl (درجة الحموضة 7.5) لعمل محلول العمل بتركيز نهائي يبلغ 500 ميكرومتر L-012. حافظ على محلول المخزون مجمدا وتخفيفه إلى محلول العمل قبل الاستخدام.
2. تحضير محلول الاستنباط الذي يحتوي على PAMP و L-012 وبيروكسيداز الفجل الحار (HRP ؛ 10 مجم / مل في ddH₂O). للحصول على محلول استنباط 10 مل ، امزج 9.4 مل من محلول 50 ملي تريس هيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.5) ، و 400 ميكرولتر من محلول L-012 ، و 100 ميكرولتر من HRP ، و 100 ميكرولتر من flg22 (PAMP ؛ 10 ملي مولار في ddH₂O). للتحكم السلبي ، أضف 100 ميكرولتر من ddH₂O بدلا من PAMP.
   ملاحظه: احتفظ بمحاليل الاستنباط المحضرة في درجة حرارة الغرفة لتجنب الإجهاد البارد على أنسجة الأرز. يمكن أيضا استخدام PAMPs الأخرى للعلاج حسب الحاجة ، مثل الكيتين (20 نانوغرام / مل في التركيز النهائي). نظرا لأن L-012 حساس للضوء ، قم بتغطية جميع الأنابيب التي تحتوي على محلول L-012 بورق الألمنيوم.

3. بدء تشغيل البرنامج وإعداد البروتوكول باستخدام قارئ اللوحة الدقيقة المشار إليه (انظر جدول المواد)

ملاحظة: يستغرق إعداد معلمات برنامج قارئ الألواح الدقيقة بعض الوقت. يوصى بتجهيز الجهاز والبروتوكول (بنقرة واحدة للمتابعة) قبل إضافة حل الاستنباع.

1. ابدأ تشغيل البرنامج. انقر فوق الزر التجارب لإنشاء بروتوكول جديد أو استخدام بروتوكول موجود.
2. انقر فوق الإجراء في النافذة المنبثقة لإعداد اللوحة. حدد الآبار من اللوحة المراد مراقبتها.
3. انقر فوق Start Kinetic لإعداد إجمالي وقت التشغيل والفاصل الزمني للقراءة. اضبط وقت التشغيل على 35 دقيقة أو أكثر، وفقا للمتطلبات التجريبية. للحصول على القراءات بشكل متكرر قدر الإمكان، حدد الحد الأدنى للفاصل الزمني. لوقت التكامل ، اختر 1 ثانية أو أكثر ، اعتمادا على شدة الإشارة.
   ملاحظة: يعتمد الفاصل الزمني للقراءة على عدد العينات ومدة تكامل الإشارة.
4. انقر فوق التحقق من الصحة | موافق لتأكيد الإعدادات.
5. انقر فوق اكتشاف اللوحة الجديدة في النافذة المنبثقة وانتظر حتى يطالب البرنامج مربع حوار لوحة التحميل. ضع اللوحة المراد اختبارها على الناقل.
6. توقف هنا لانتظار إنشاء نظام الاستنباط (في القسم التالي). بمجرد أن يصبح نظام الاستنباط جاهزا ، انقر فوق تشغيل لبدء القراءة.

4. إنشاء نظام الاستنباط وقياس إنتاج ROS في الوقت الفعلي

1. قم بإزالة ddH₂O بعناية من الآبار التي تحتوي على الأنسجة المعالجة مسبقا ، وتجنب أي تلف أو جفاف في الأنسجة.
2. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 200 ميكرولتر من محلول الاستنباط إلى الآبار التي تحتوي على الأنسجة.
3. يرج برفق حتى يمتزج. انقر فوق تشغيل لبدء الاكتشاف.
   ملاحظه: مع علاج PAMP ، تستجيب الأنسجة النباتية وتنتج أنواع الأكسجين التفاعلية بسرعة كبيرة. لذلك ، يقترح معالجة التحكم السلبي بدون PAMP أولا لتقليل وقت العملية عندما تكون هناك علاجات متعددة. قم بإجراء العملية في أسرع وقت ممكن لتقليل تأخير الاستنباط بين العلاجات. كلما كان الوقت بين إضافة محلول الاستنباط وبدء الكشف أقصر ، كان التقاط البيانات التجريبية المهمة أفضل.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: حالة نمو ومراحل شتلات الأرز لأخذ عينات من الغمد وأجزاء من غمد الأرز وأوراق الأرز المستخدمة في الفحص. (أ) يمكن أخذ عينات من شتلات الأرز المزروعة على وسط 1/2 مللي ثانية في ظل ظروف معقمة لمدة 10 أيام لفحص ROS. استزرعت بذور الأرز المعقمة على 1/2 مللي ثانية متوسطة ونمت في فترة ضوئية 12 ساعة فاتحة / 12 ساعة مظلمة في قارورة زجاجية شفافة قطرها 8.5 سم وارتفاعها 15 سم. (

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 96 بئر لوحة ميكروتيتر دبليو إتش بي دبليو إتش بي -96-01 إف إل جي 22 سانغون للتكنولوجيا الحيوية ص 20973 بامب الجيل 5 بيوتك برمجيات L-012 فوجي فيلم هاتف 120-04891 8-أمينو-5-كلورو-7-فينيل-2،3-ثنائي هيدروبيريدو [3،4-د] بيريدازين-1،4-ديون، CAS #: 143556-24-5 قارئ اللوحة الدقيقة بيوتك التآزر 2 بيروكسيداز من الفجل الحار (HRP) سيغما ص 8375 العينات ميلتكس 15110-40 تريس سانغون للتكنولوجيا الحيوية A610195