اختبار لدراسة البلعمة التي تحركها مستقبلات Fcγ في الطبقات الأحادية للخلايا الأحادية

الملخص

المصدر: Tong ، T. N. ، et al. استخدام مقايسة أحادية الطبقة أحادية الخلية لتقييم البلعمة بوساطة مستقبلات fcγ. J. Vis. Exp. (2017)

يعرض هذا الفيديو مقايسة أحادية الطبقة أحادية الخلية تستخدم الخلايا الوحيدة الأولية من الدم المحيطي لتقييم البلعمة بوساطة مستقبلات Fcγ مع خلايا الدم الحمراء R₂R 2 R₂ المضادة بالأجسام المضادة بولي D.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

فئة

1. عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي

1. الحصول على دم كامل للإنسان من متبرع سليم أو مريض عن طريق بزل الوريد باستخدام المكانس الكهربائية التي تحتوي على مضادات التخثر الحمضية والسترات وسكر العنب (ACD) (أنابيب صفراء علوية).
   ملاحظه: يمكن تخزين الدم الكامل في ACD في درجة حرارة الغرفة (18-22 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 36 ساعة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. عادة ما تكون 1-2 أنابيب فراغ سعة 10 مل من الدم الكامل كافية للمقايس.
2. تمييع الدم الكامل 1: 1 فولت / حجم في وسط RPMI كامل دافئ (RPMI-1640 مكمل بمصل بقري جنيني 10٪ ، 20 ملي مولار HEPES ، و 0.01 مجم / مل جنتاميسين).
3. عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) من الدم الكامل المخفف باستخدام الطرد المركزي المتدرج للكثافة ، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة (انظر قائمة المواد). ضع طبقة من الدم المخفف ببطء شديد فوق تدرج الكثافة (دافئ إلى درجة حرارة الغرفة ، 18-22 درجة مئوية).
   ملاحظه: قلل من كمية الخلط في الواجهة من أجل الفصل الأمثل للدم عن طريق وضع طبقات بعناية من خليط الدم بطريقة متساقطة أو باستخدام ماصة.
   1. اسمح لخليط الدم بوضع طبقة ببطء فوق الجزء العلوي من تدرج الكثافة عن طريق وضع طرف الماصة بالقرب من تدرج الكثافة وتمكين خليط الدم من الجري على جانب الأنبوب ببطء شديد.
   2. اعتمادا على حجم التجربة ، طبقة 10 مل من خليط الدم فوق 3 مل من تدرج الكثافة (في أنبوب 15 مل) أو طبقة 35 مل من خليط الدم فوق 15 مل من تدرج الكثافة (في أنبوب 50 مل). عادة ما ينتج 10 مل من الدم الكامل 10 ملايين PBMCs ، مع بعض الاختلافات من متبرع إلى متبرع.
      ملاحظه: من المهم جدا عدم خلط خليط الدم مع تدرج الكثافة. يجب أن يضع خليط الدم فوق تدرج الكثافة ويرتفع ببطء حتى يصبح الدم كله فوق تدرج الكثافة.
   3. الطرد المركزي الخليط متعدد الطبقات على حرارة 700 × جم لمدة 30 دقيقة بدون فرامل. يجب فصل خليط الطرد المركزي إلى 5 طبقات (من أعلى إلى أسفل): البلازما ، الطبقة المصفرة (التي تحتوي على PBMCs) ، مادة تدرج الكثافة ، الخلايا الحبيبية ، وكرات الدم الحمراء.
   4. قم بإزالة غالبية البلازما والتخلص منها واسترجع محتوى الطبقة المصفرية (PBMC) بعناية في أنبوب جديد سعة 15 مل باستخدام ماصة باستور ولمبة شفط.
      ملاحظه: تتم إزالة طبقة الطبقة المصفرية بشكل فعال عن طريق تطبيق الشفط على ماصة باستور أثناء إجراء حركة دائرية حول الجزء الخارجي من الطبقة، مع وضع طرف الماصة على الأنبوب.
4. اغسل PBMCs المعزولة ثلاث مرات في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدرجة الحموضة 7.3 عن طريق الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 10 دقائق (مع فرامل كاملة) بين الغسل. إعادة تشكيل حبيبات PBMC في وسط RPMI كامل. اعتمادا على حجم الحبيبات ، يكفي 3-7 مل من المتوسط.
5. عد PBMC باستخدام التريبان الأزرق ومقياس كثافة الدم. عد فقط تلك الخلايا غير الملطخة باللون الأزرق. أعد تكوين PBMCs إلى 1,750,000 خلية / مل في وسط RPMI كامل.
6. بذرة 400 ميكرولتر (700,000 خلية) في كل بئر من شريحة مكونة من 8 غرف. احتضان الشريحة في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة بالكامل بدرجة حرارة 37 درجة مئوية (مكملة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لمدة ساعة واحدة للسماح للخلية الوحيدة / البلاعم بالالتصاق.

< p class = "jove_title" >2. المعالجة المسبقة للخلايا الوحيدة الملتصقة

ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية فقط إذا كنت تبحث عن طرق لتثبيط أو تعزيز البلعمة.

المعالجة
1. المسبقة للخلايا الوحيدة الملتصقة بأي دواء (أدوية) أو مركب (مركبات) ذات أهمية. أعد تكوين الدواء (الأدوية) أو مواد الاختبار الأخرى إلى التركيز المطلوب باستخدام وسيط RPMI كامل.
   ملاحظه: على سبيل المثال ، عادة ما يتم استخدام 200 ميكروغرام / مل من IVIG لإنتاج تثبيط 95-100٪ للبلعمة عند استخدام الخلايا الوحيدة البشرية.
2. قم بالشفط والتخلص من المادة الطافية التي تحتوي على أي خلايا غير ملتصقة من الشريحة المكونة من 8 غرف بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة (بعد الخطوة 1.6). استبدلها ب 400 ميكرولتر من دواء أو علاج آخر واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
   1. عند شفط المحاليل واستبدالها في الشريحة المكونة من 8 غرف ، تأكد من التحكم في تدفق السوائل حتى لا ترفع الخلايا ضعيفة الالتصاق. أيضا ، اعمل مع 2-3 آبار فارغة فقط في المرة الواحدة وتجنب تجفيف الآبار.
      ملاحظه: عادة ، يتم إجراء كل علاج في ثلاث نسخ تقنية.

3. Opsonization لخلايا الدم الحمراء R₂R₂

ملاحظة: تستخدم_{كرات الدم الحمراء} R₂R 2 Opsonized كعنصر تحكم إيجابي في البلعمة بوساطة FcγR. يجب تخزين Naïve R₂R₂ في محلول Alsever (لإطالة العمر الافتراضي) عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. يصنع محلول Alsever داخليا ويتكون من 0.8٪ وزن / حجم سترات ثلاثي الصوديوم (ثنائي هيدرات) ، و 1.9٪ وزن / حجم سكر العنب ، و 0.42٪ وزن / حجم كلوريد الصوديوم ، و 0.05٪ وزن / حجم حامض الستريك (أحادي الهيدرات). إذا لم تكن خلايا R₂R₂ متوفرة ، فيمكن استخدام خلايا أخرى ذات نمط ظاهري Rh ، مثل R₁R₂ أو R₁R₁ أو R₁r أو R₂r.

1. اغسل خلايا الدم الحمراء R₂R₂ (cDE / cDE) في PBS ما مجموعه ثلاث مرات باستخدام الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق لكل منها.
   ملاحظه: يعتمد مقدار كرات الدم الحمراء المطلوبة على الحجم التجريبي ويمكن حسابها مرة أخرى. اغسل دائما كمية زائدة من كرات الدم الحمراء ، حيث تفقد كرات الدم الحمراء أثناء كل غسلة بسبب التحلل أو أثناء إزالة المادة الطافية. على سبيل المثال ، في تجربة مع 5 علاجات و 2 عناصر تحكم ، تم إجراؤها جميعا في ثلاث نسخ فنية ، هناك ما مجموعه 21 بئرا. يشير 21 بئرا تحتوي على 400 ميكرولتر / بئر من خليط كرات الدم الحمراء بنسبة 1.25٪ إلى الحاجة إلى 105 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء المعبأة والمعبأة. يجب غسل 200 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء في البداية ويجب إجراء 150 ميكرولتر للتأكد من وجود كمية كافية من كرات الدم الحمراء لخطوة البلعمة.
2. قم بمعالجة حبيبات R₂R₂ المغسولة مع 1: 1 v / v الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة ل D من المصل البشري واحتضانها لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، مع الخلط المتقطع.
   ملاحظه: إذا لم تكن الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة ل D متوفرة ، فمن الممكن استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل D ، وهي متوفرة تجاريا ، أو مضادة D التي تستخدم عادة للوقاية المناعية من Rh ، والتي يمكن الحصول عليها من بنوك الدم أو خدمات نقل الدم. يجب إجراء اختبار التحسين في البداية عند إعداد الفحص ، وعند تبديل الكثير من الأجسام المضادة متعددة النسيلة غير المعيار أو التحول إلى جسم مضاد وحيد النسيلة. هذا لتحديد التركيز أو الحجم الأمثل ل anti-D المطلوب لنتيجة اختبار مضادات الغروبيولين (IAT) بين 3+ و 4+ ونتيجة البلعمة لما بين 70-90 كرات الدم الحمراء البلعمية لكل 100 خلية وحيدة محسوبة.
3. اغسل R₂R₂ opsonized ما مجموعه ثلاث مرات في PBS باستخدام الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق لكل منهما.
   ملاحظه: يمكن تأكيد المرجع الناجح ل R₂R₂ عن طريق إجراء IAT غير مباشر. باختصار ، تتم إضافة الأجسام المضادة الثانوية متعددة النسيلة المضادة للإنسان لربط الأجسام المضادة الأولية المضادة على أسطح كرات الدم الحمراء ، ويمكن ملاحظة الإشارة المضخمة في شكل تضخم الدم. يمكن العثور على بروتوكول الشركة المصنعة التفصيلي في ملف المواد التكميلية.
4. أعد تكوين حبيبات R₂R₂ المغسولة إلى 1.25٪ حجم / حجم باستخدام وسيط RPMI كامل.
   ملاحظه: يمكن تخزين R₂R₂ الزائد في محلول Alsever عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.

< p class = "jove_title" >4. البلعمة بوساطة مستقبلات Fc

1. استنشق الدواء أو المادة الطافية المتوسطة من الشريحة المكونة من 8 غرف وأضف 400 ميكرولتر من خليط 1.25٪ v / v R₂R₂. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
2. بعد 2 ساعة من الحضانة ، قم بإزالة الغرف باستخدام محولات الشركة المصنعة. امسح الفائض_{R 2}R₂ على منشفة ورقية. تأكد من أن الشريحة لا تجف.
3. املأ دورق سعة 100 مل ب PBS. اغمر الشريحة واغسلها عن طريق تحريك الشريحة ببطء ذهابا وإيابا (حوالي 30-40 ضربة) لإزالة غالبية R₂R₂ غير البلعمة.
4. قم بإزالة الشريحة من برنامج تلفزيوني. تخلص من PBS الزائد باستخدام منشفة ورقية أو منديل وجفف الشريحة بالهواء.
5. قم بإصلاح الشريحة المجففة بالهواء في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 45 ثانية. ثم جفف الشريحة الثابتة بالهواء.
   ملاحظه: يمكن إصلاح الشرائح باستخدام طريقة أخرى أكثر توافقا مع تلطيخ المصب ، مثل صبغة Grünwald-Giemsa 21 أو صبغة Wright-Giemsa.
6. قم بتركيب الشريحة باستخدام وسيط تركيب Elvanol محلي الصنع (أو وسيط تثبيت آخر متاح تجاريا) وأضف أغطية.
   ملاحظه: يتكون وسيط تركيب Elvanol من 15٪ وزن / حجم راتنج كحول البولي فينيل و 30٪ v / v glycerin في PBS. يسخن الخليط حتى يذوب كل الراتنج ويخلط الجلسرين بشكل متجانس. يمكن استبدال هذا بوسيط تركيب آخر متاح تجاريا.
7. اترك الحامل يجف طوال الليل قبل القياس الكمي.

< p class = "jove_title" >5. القياس الكمي للبلعمة

1. باستخدام مجهر تباين الطور وعدسة موضوعية 40X ، حدد كمية الأحداث البلعمية يدويا عن طريق حساب ما لا يقل عن 200 خلية وحيدة وعدد البلعمة R₂R₂ داخل هذه الخلايا الوحيدة. ضع عداد واحد في كل يد لتحديد عدد الخلايا الوحيدة وعدد الخلايا البلعمة R₂R_{2 في} وقت واحد.
2. احصل على متوسط مؤشر البلعمة بقسمة عدد البلعمة R₂R₂ على عدد الخلايا الوحيدة وضربها في 100. عبر عن البيانات كمتوسط (متوسط مؤشر البلعمة) ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات RPMI 1640 RPMI 1640 R8758 محلول ملحي مخزن بالفوسفات سيغما د8537 شرائح من 8 غرف مختبر تيك ل 154534 خلايا الدم الحمراء R2R2 (cDE/cDE) متاح تجاريا (على سبيل المثال ، كاشف http:// www.bio-rad.com/en-ca/product/ خلايا الدم الحمراء) مضاد D متعدد النسيلة من مصل بشري جاما بيولوجيكس 02247724 الدين يمكن استبداله بمضاد D أحادي النسيلة المتاح تجاريا أو بالجلوبيولين المناعي Rh 100٪ ميثانول كاليدون 6700-1-42 زلات الغطاء VWR هاتف: 48366 067