قياس الجاذبية في مجموعة مختلطة من الخلايا التائية

الملخص

المصدر: Juvet ، S. C. et al. ، قياس نشاط الخلايا التائية باستخدام قياس تدفق التصوير.J. Vis. Exp.(2017)

يوضح هذا الفيديو طريقة لتقييم النشاط الجاذب في مجموعات الخلايا التائية المختلطة من خلال مراقبة التفاعلات مع الخلايا المتغصنة الحاملة للمستضد الخيفي ، مما يؤدي إلى تكوين نقاط الاشتباك العصبي المناعية. يكشف التلوين التفاضلي والقياس الكمي للمضاعفات المحتوية على المشبك عبر قياس التدفق الخلوي عن نشاط الخلايا التائية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الكواشف والمواد المطلوبة

1. تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 2٪ مصل بقري جنين (FBS) ("محلول الغسيل"). تحضير PBS بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 2٪ (FCS) يحتوي على 0.1٪ منظف غير أيوني ("مخزن غسيل بيرم" ؛ انظر جدول المواد). تحضير PBS بنسبة 1.5٪ فورمالديهايد.
   ملاحظه: الفورمالديهايد مادة أكالة ويحتمل أن تكون مسرطنة ويجب التعامل معها أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
2. تحضير PBS يحتوي على 2٪ FBS و 0.5 ملي مولار حمض الإيثيلين دياأمين تترا أسيتيك (EDTA) لفصل الخلايا المغناطيسية ("المخزن المؤقت MCS").
3. تحضير 50 ميكروغرام / مل من الفالودين والفلوريسين إيزوثيوسيانات (فالويدين-FITC) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). تحضير صبغة نووية 1 مجم / مل (على سبيل المثال 1 مجم / مل 7 أكتينومايسين أمينو D (7-AAD) في DMSO أو صبغة ثنائي بنزيميد ؛ انظر جدول المواد) في DMSO. قم بإعداد الأجسام المضادة المسماة بالفلوروكروم المناسبة للخلايا ذات الأهمية ومقياس تدفق التصوير.
4. الحصول على الأنسجة الحيوانية (مثل الغدد الليمفاوية والطحال) كمصدر للخلايا التائية والأنسجة الحيوانية الخيفية (مثل الطحال ونخاع العظام) كمصدر للخلايا أو الأسلاف العارضة للمستضد.
5. قم بإعداد وسط زراعة الخلايا (على سبيل المثال ، وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 أو وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل بنسبة 10٪ FBS) ، و 50 ميكرومتر 2-mercaptoethanol ، والبنسلين ، والستربتومايسين واحصل على ألواح زراعة الخلايا 24 و / أو 96 بئر.

< p class = "jove_title" >2. تحضير الخلايا العارضة للمستضد (APCs)

ملاحظة: من الناحية النظرية ، يمكن فحص أي مجموعة من APC بهذه الطريقة. تم رفع دعوى قضائية ضد الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع عظم الفأر غير الناضج (DCs) مثل APCs في هذه الحالة. توجد العديد من البروتوكولات لتوليد هذه الخلايا. باختصار ، تم استخدام البروتوكول التالي.

1. اغسل النخاع من عظم الفخذ والظنبوب إلى RPMI 1640 أو DMEM.
2. مرر الخلايا العالقة عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر لإزالة قطع صغيرة من العظام والحطام.
3. قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي ثم تحلل الخلايا الحمراء باستخدام عازلة كلوريد الأمونيوم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي (400 × جم ، 5 دقائق) وإعادة تعليق حبيبات الخلية.
5. اغسل الخلايا في 5-10 مل من المخزن المؤقت للغسيل ، الحبيبات بالطرد المركزي (400 × جم ، 5 دقائق) ، وأعد تعليق حبيبات الخلية.
6. قم بإثراء السلائف المكونة للدم على عمود فصل الخلايا عن طريق تسمية الخلايا بمضادات CD3 الحيوية (5 ميكروغرام / مل) ، ومضاد B220 (5 ميكروغرام / مل) ، ومضاد لمعقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية (1 ميكروغرام / مل) ، ومضاد ل CD11b (5 ميكروغرام / مل) الأجسام المضادة.
7. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي (400 × جم ، 5 دقائق) وأعد تعليق حبيبات الخلية.
8. احتضان الخلايا بالميكروبيدات المغناطيسية المضادة للبيوتين (انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
9. اغسل الخلايا وحبيبها (400 × جم ، 5 دقائق) وأعد تعليقها في 1 مل من المخزن المؤقت MCS قبل إزالة الخلايا المسماة باستخدام عمود فصل الخلايا المغناطيسية ذو الاختيار الموجب الكبير (LS) مجهزا ب 3 مل من المخزن المؤقت MCS ووضعه في مغناطيسه. اغسل العمود 3 مرات ب 3 مل من المخزن المؤقت MCS ؛ سيحتوي التدفق على الخلايا المطلوبة.
10. استزراع الخلايا التي تمر عبر العمود لمدة 6 أيام في RPMI 1640 أو DMEM مكملا ب 2 نانوغرام / مل عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والضامة المؤتلف (GM-CSF) و 2 نانوغرام / مل من عامل النمو البشري المؤتلف β1 (TGFβ1). استبدل نصف الوسط كل يومين بوسط كامل طازج يحتوي على 2 نانوغرام / مل لتر GM-CSF و TGFβ1. < / > ملاحظة: TGFβ1 البشري له نشاط في خلايا الفأر. تم إنشاء البيانات باستخدام هذه المراكز غير الناضجة. قد تكون الخلايا الأخرى (على سبيل المثال ، الخلايا البائية و DCs الناضجة) مناسبة كخلايا ناقلة متمردة جنيه المدرعة ولكن لم يتم اختبارها في هذا الفحص.
11. حفظ التيار المستمر بالتبريد في 90٪ مصل / 10٪ DMSO وتخزينها في النيتروجين السائل ؛ تعافى في يوم الاستخدام. قبل الاستخدام ، احسب عدد التيار المستمر القابل للحياة في مقياس كثافة الدم باستخدام استبعاد التريبان الأزرق. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط الاستزراع بالكثافة المناسبة (انظر الخطوة 4.1) قبل استخدامها في القسم 4.

< p class = "jove_title" >3. تحضير الخلايا التائية

1. استخدم طرق الاختيار السلبية لتجنب إرسال إشارات تنشيط أو مثبطة إلى الخلايا عن غير قصد.
   ملاحظة: في هذا المثال، يتم تحضير خلايا CD4⁺ T للتحليل.
   1. لتحضير خلايا CD4 ⁺ T من طحال الفأر ، اهرس الطحال من خلال مصفاة خلوية 70 ميكرومتر باستخدام مكبس المحقنة. اغسل مصفاة الخلية بمحلول الغسيل.
   2. حبيبات الخلايا العالقة عن طريق الطرد المركزي (400 × جم ، 5 دقائق) ثم تحلل الخلايا الحمراء عن طريق إعادة تعليق الحبيبات في مخزن مؤقت لكلوريد الأمونيوم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   3. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي (400 × جم ، 5 دقائق) وأعد تعليق الحبيبات.
   4. اغسل الخلايا في 5-10 مل من محلول الغسيل والحبيبات عن طريق الطرد المركزي (400 × جم ، 5 دقائق). أعد تعليق الحبيبات.
   5. تلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة البيوتينيل ل CD8 ، ومركب التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الثانية (معقد التوافق النسيجي الثاني ، 1 ميكروغرام / مل) ، و CD19 (5 ميكروغرام / مل). احتضن لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   6. اغسل الخلايا في 10 مل من محلول الغسيل والحبيبات عن طريق الطرد المركزي (400 × جم ، 5 دقائق). أعد تعليق الحبيبات.
   7. احتضان الخلايا بالميكروبيدات المغناطيسية المضادة للبيوتين (انظر جدول المواد) وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة.
   8. اغسل الخلايا في 10 مل من محلول الغسيل والحبيبات عن طريق الطرد المركزي (400 × جم ، 5 دقائق) ؛ أعد تعليق الحبيبات.
   9. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت MCS وإثراء خلايا CD4 ⁺ T عبر عمود فصل الخلايا المغناطيسية المعبأ ب 3 مل من المخزن المؤقت MCS على مغناطيس. اغسل العمود 3 مرات باستخدام 3 مل من المخزن المؤقت MCS. سيحتوي تدفق العمود على الخلايا التائية المخصبة.
2. من خلال قياس التدفق الخلوي القياسي ، قم بتقييم نقاء الخلايا التائية باستخدام حصة من الخلايا المختارة سلبا. تلطيخ الخلايا باستخدام مترافق فلوروكروم - ستربتافيدين (لتحديد أي خلايا تحمل علامة البيوتين كان يجب إزالتها على العمود) وجسم مضاد أو أجسام مضادة لتحديد مجموعة الخلايا التائية ذات الأهمية (CD4 في هذه الحالة) ؛ نقاء ≥85٪ مقبول.
   1. عد الخلايا التائية في مقياس كثافة الدم عن طريق استبعاد تريبان الأزرق (≥90٪ من الجدوى مقبولة).
      ملاحظة: يحتوي المخزن المؤقت MCS على EDTA، والذي يجب إزالته قبل المقايسة. لتحقيق ذلك ، قم بتكبيل الخلايا عن طريق الطرد المركزي (400 × جم ، 5 دقائق) وغسلها في 1 مل من محلول الغسيل. قم بتحبيير الخلايا مرة أخرى (400 × جم ، 5 دقائق) وأعد تعليقها في وسط الاستزراع بالكثافة المناسبة (انظر الخطوة 4.1).

4. احتضان الخلايا التائية والتيار المستمر

1. الخلايا التائية للبذور و DCs بنسبة 2: 1 T: DC في صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا أو 96 بئرا. تأكد من أن حجم الاستزراع النهائي هو ≤500 ميكرولتر لألواح 24 بئرا أو ≤50 ميكرولتر للألواح ذات 96 بئرا.
   ملاحظة: تشجع وحدات التخزين الأصغر التفاعلات بين الخلية والخلايا وتتيح مساحة لمخازن التثبيت اللاحقة.
   1. اضبط أرقام الخلايا الدقيقة تجريبيا ، ولكن كدليل عام ، استخدم 1 × 10⁶ خلايا T و 0.5 × 10⁶ تيار مستمر لكل بئر (لوحة 96 بئر). يجب اعتبار هذه الحد الأدنى من عدد الخلايا لأن استخدام عدد أقل من الخلايا يجعل تعداد المشابك المناعية أمرا صعبا.
      1. لزيادة عدد الخلايا ، قم بإعداد الآبار والتجمع المتماثل بعد الخطوة 5 (التثبيت).
         ملاحظة: عند إنشاء الآبار المكررة ، ينصح بزرع الخلايا التائية في جميع الآبار أولا ثم زرع الخلايا التائية في جميع الآبار. هذا يقلل من التناقضات في وقت الحضانة بين الآبار.
2. احتضان اللوحة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO₂.

< p class = "jove_title" >5. إصلاح الخلايا في اللوحة

1. أضف 3 أضعاف حجم الثقافة البالغ 1.5٪ من الفورمالديهايد في PBS إلى كل بئر واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ؛ من المهم إصلاح الخلايا قبل إزالتها من اللوحة لتقليل اضطراب تفاعلات الخلية الخلية.
2. نقل الخلايا في اللوحة إلى أنابيب للغسيل والتلطيخ اللاحق. في هذه المرحلة ، ضع جانبا خلايا إضافية للتحكم في البقعة الواحدة. بصرف النظر عن هذه الضوابط ، يجب تلطيخ الثقافة بأكملها بكوكتيل الأجسام المضادة (انظر الخطوة 4.1.1).

< p class = "jove_title" >6. خلايا البقع

1. تلطخ الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل الذي يحتوي على مزيج من الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم المرغوبة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء.
   ملاحظة: يشتمل الكوكتيل على أجسام مضادة خاصة بالخلايا التائية والخاصة ب APC. يجب اختيار الفلوروكرومات بحيث يمكن تمييزها باستخدام تكوين مقياس تدفق التصوير. في التجارب الموضحة هنا ، تم استخدام CD11b المترافق بالفلوروفور الأزرق (5 ميكروغرام / مل ، انظر جدول المواد) و CD90.2 المترافق APC (5 ميكروغرام / مل).
2. اغسل الخلايا في 1 مل من محلول الغسيل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 400 × جم. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت للغسيل الذي يحتوي على الفالويد FITC عند 0.05-0.5 ميكروغرام / مل واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. < / > ملاحظة: تعمل تركيزات الفالودين FITC البالغة حوالي 0.1 ميكروغرام / مل بشكل جيد لخلايا الفئران ، ولكن من المتوقع أن يختلف التركيز المناسب حسب المورد ونوع الخلية ومقياس تدفق التصوير.
3. اغسل الخلايا في 1 مل من محلول التجعيد / الغسيل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 400 × جم. صب المادة الطاففة. أعد تعليق الخلايا في محلول تجعيد / غسيل يحتوي على صبغة نووية بالتركيز المناسب (على سبيل المثال ، حوالي 25 ميكروغرام / مل 7-AAD) واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء.
4. اغسل الخلايا في 1 مل من محلول التجعيد / الغسيل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 400 × جم. صب المادة الطاففة. اغسل الخلايا مرة واحدة في المخزن المؤقت للغسيل ، والحبيبات ، وأعد تعليقها في 50-100 ميكرولتر من محلول الغسيل ، وانقل الخلايا إلى أنابيب صغيرة لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة.
5. انتقل إلى الحصول على البيانات على الفور أو قم بتخزين الخلايا عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء لمدة تصل إلى عدة أيام قبل الاستحواذ على مقياس تدفق التصوير.
   ملاحظة: تم تخزين الخلايا بنجاح بهذه الطريقة لمدة تصل إلى 7 أيام. قد يكون التخزين أطول ممكنا ولكن لم يتم اختباره.

7. الحصول على البيانات

1. قم بتهيئة وتكوين مقياس تدفق التصوير الخلوي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تأكد من استقرار قلب التدفق قبل جمع أي بيانات.
2. احجز قناة واحدة للحصول على صور المجال الساطع. احصل على بيانات التحكم في بقعة واحدة مع إيقاف تشغيل قناة المجال الساطع.
   1. انقر فوق الزر "تحميل" وأدخل أنبوبا يحتوي على عينة ملطخة بالكامل (عينة ملطخة بجميع الفلوروكرومات المطلوبة) في الحامل.
   2. في نافذة "مساحة العمل" ، حدد وأنشئ مخططا مبعثرا جديدا مع نسبة العرض إلى الارتفاع فوق المنطقة والمفردات البوابة حيث تكون نسبة العرض إلى الارتفاع قريبة من 1. قم بإنشاء مخطط مبعثر جديد لكل قناة مستخدمة (شدة القناة في المحور الأفقي).
   3. لكل فلوروكروم ، تحقق من السكان الإيجابيين ، وإذا لزم الأمر ، اضبط جهد الليزر في مربع "الإضاءة".
   4. قم بتفريغ الأنبوب وقم بتحميل أول أنبوب أحادي الملون.
   5. في مربع "إعدادات الاستحواذ"، اكتب اسم العينة وحدد عدد الأحداث التي يجب جمعها؛ إذا كانت وصمة عار واحدة (لضوابط التعويض)، فإن 1,000 - 2,000 حدث كافية.
   6. في مربع "القنوات" ، حدد القنوات التي تم تلطيخ كل عينة بها. بالنسبة للعناصر الموسيقية أحادية البقعة ، يجب تحديد جميع القنوات مع الحقل الساطع والمبعثر الجانبي. انقر فوق الزر "تسجيل" أسفل مربع "الاستحواذ" ؛ عندما يصل عدد الأحداث إلى الحد المحدد، سيتوقف الاستحواذ تلقائيا.
   7. انقر فوق الزر "رجوع" لتفريغ الأنبوب. كرر الخطوات 7.2.4 - 7.2.6 لكل عنصر تحكم أحادي البقعة. اعتمادا على مقياس الخلوي والبرنامج ، قد لا يكون من الممكن ضبط جميع البوابات الموضحة في الشكل 1 أثناء الاستحواذ (يتم إجراء بوابات أكثر دقة أثناء التحليل ؛ انظر القسم 8).
3. احصل على عينات كما هو الحال بالنسبة للعينات أحادية اللون (في الخطوة 7.2)، ولكن في مربع "القنوات"، حدد جميع القنوات المطلوبة، بما في ذلك قناة المجال الساطع.
   1. قبل تسجيل البيانات ، تحقق للتأكد من أن شدة القناة مناسبة لتحديد مجموعات الخلايا المطلوبة. إذا لم يكن الأمر كذلك، فاضبط إعدادات الليزر وأعد تسجيل عناصر التحكم أحادية البقعة باستخدام الإعدادات الجديدة، كما هو موضح في الخطوة 7.2.
   2. لكل عينة ، احصل على عشرات الآلاف من الأحداث.
      ملاحظه: في معظم الظروف ، تشكل أحداث التلامس الخلوي أقلية صغيرة من إجمالي عدد الخلايا (معظمها خلايا مفردة). بشكل عام ، من المستحسن أن يكون لديك ما لا يقل عن 100 حدث في بوابة التلامس الغشائية النهائية.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. استراتيجية البوابات المستخدمة لتحديد المشابك المناعية النشطة. أ. يتم تحديد الأحداث في التركيز البؤري من جميع الأحداث من خلال مراجعة صور الخلية استنادا إلى جذر متوسط المربع لمعدل تغير ملف تعريف كثافة الصورة (Gradient RMS) باستخدام قناة المجال الساطع (القناة 4، Ch04)، كما هو موضح في النص. ب. من بين الأحداث قيد التركيز البؤري، يتم تمييز المزدوجات عن الخلايا المفردة ع...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات محلول ملحي مخزن بالفوسفات مختلف يتفاوت حمض الإيثيلين ديامينيتتراأسيتيك ، محلول 0.5 متر ثيرمو فيشر العلمي AM9260G Triton X-100 منظف غير أيوني سيجما ألدريتش X100 بيتا ميركابتو إيثانول سيجما ألدريتش م 3148 ثنائي ميثيل سلفوكسيد سيجما ألدريتش د8418 فورمالدهيد سيجما ألدريتش F1635 المحلول هو 37٪ فورمالديهايد وبالتالي يجب تخفيفه 25 مرة لمحلول 1.5٪ مصافي الخلايا ، حجم المسام 70 ميكرومتر فيشر ساينتيك 08-771-2 الفالويدين - فلوريسين إيزوثيوسيانات سيجما ألدريتش ص 5282 7-أمينوأكتينومايسين د ثيرمو فيشر العلمي أ 1310 إعادة التكوين في DMSO مضاد للفأر مترافق ب Allophycocyanin CD90.2 العلوم البيولوجية الإلكترونية 17-0902 المحيط الهادئ الأزرق المترافق مضاد للفأر CD11b العلوم البيولوجية الإلكترونية 48-0112 تم استبدال أزرق المحيط الهادئ ب eFluor 450 البيوتينيل مضاد للفأر CD3 العلوم البيولوجية الإلكترونية 13-0032 معقد التوافق النسيجي الكبير المضاد للفأر من الفئة الثانية العلوم البيولوجية الإلكترونية 13-5321 [م] البيوتينيل المضاد للفأر B220 العلوم البيولوجية الإلكترونية 13-0452 البيوتينيل المضاد للفأر CD8 العلوم البيولوجية الإلكترونية 13-0081 البيوتينيل المضاد للفأر CD19 العلوم البيولوجية الإلكترونية 13-0193 الميكروبيدات المضادة للبيوتين ميلتيني بيوتيك 130-090-485 أعمدة LS ميلتيني بيوتيك 130-042-401 فاصل الخلايا المغناطيسية MidiMACS ميلتيني بيوتيك 130-042-302 الماوس المؤتلف GM-CSF بيبروتك 315-03 المؤتلف البشري TGFβ1 بيبروتك 100-21 TGFβ1 البشري له نشاط على خلايا الفئران Amnis ImageStream X Mark II Amnis/EMD Millipore غير متاح مقياس التدفق الخلوي للتصوير ؛ التفاصيل متوفرة في http://www.emdmillipore.com/ برامج الأفكار Amnis/EMD Millipore غير متاح تنزيل مجاني (التسجيل مطلوب): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20 وسط زراعة الخلية مختلف يتفاوت مصل الأبقار الجنينية مختلف يتفاوت لوحات زراعة الخلايا مختلف يتفاوت