تحديد وتعداد الخلايا المناعية في سائل الغسيل القصبي السنخي عن طريق قياس التدفق الخلوي

الملخص

المصدر: Van Hoecke، L. et al.، غسل القصبات الهوائية لرئتي الفئران لتحليل تسلل الخلايا الالتهابية.J. Vis. Exp.(2017)

يوضح هذا الفيديو استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد وحساب الخلايا المناعية المختلفة في سائل غسل القصبات الهوائية. في البداية ، يتم تحديد الخلايا المناعية المفردة باستخدام صبغة قابلة للحياة ، متبوعة بالتلوين التفاضلي لبروتينات العلامات السطحية ، مما يتيح التعداد الدقيق لكل نوع من أنواع الخلايا.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. التحضير

1. سائل الغسيل
   1. تحضير محلول ملحي متوازن مع 100 ميكرومتر حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA).
      ملاحظه: لقياس مستويات البروتين في سائل غسل القصبات الهوائية (BAL) ، يوصى بإضافة مثبطات البروتياز لمنع نشاط البروتياز في سائل BAL.
2. قسطر
   1. اصنع قسطرة عن طريق إدخال إبرة 23 جم في أنبوب بولي إيثيلين بلاستيكي شفاف 21 جم (القطر الداخلي: 0.58 مم ، القطر الخارجي: 0.965 مم ، والطول: 0.5 سم). يمكن أيضا استخدام القسطرة الجاهزة.
3. المسكنات
   1. قم بإعداد مخدر طرفي ، ويفضل أن يكون مخدرا يسبب توقف التنفس (على سبيل المثال ، محلول باربيتورات مثل البنتوباربيتال الصوديوم (>100 مجم / كجم) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)). < / > ملاحظه: يوصى باستخدام التخدير المحقون بدلا من التخدير المستنشق ، حيث أن التخدير المستنشق قد يؤثر على محتوى سائل BAL. ثاني أكسيد الكربون₂ ، على سبيل المثال ، له تأثير على درجة الحموضة في الدم وبالتالي على إعادة توزيع المركبات المختلفة.
4. المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء بكلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم (ACK)
   1. قم بإعداد مخزن مؤقت لتحلل ACK عن طريق إذابة 8.29 جم من كلوريد الأمونيوم (NH₄Cl) و 1 جم من بيكربونات البوتاسيوم (KHCO₃) في 1 لتر من H₂O مع 100 ميكرومتر EDTA ؛ يمكن أيضا شراء المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء من مصدر خارجي.

< p class = "jove_title" >2. إجراء غسل القصبات الهوائية (BAL)

1. إدخال القسطرة في القصبة الهوائية
   1. القتل الرحيم للفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق لجرعة مميتة من مخدر الباربيتورات قصير المفعول باستخدام إبرة 26 جم. للتأكد من التخدير المميت المناسب ، اضغط على المخلب الخلفي للفأر بالملقط للتحقق من منعكس القدم.
   2. ضع على ظهره على صفيحة جراحية وقم بإصلاح الفأر عن طريق تثبيت الأطراف.
   3. رش 70٪ إيثانول على الرقبة للتطهير. قم بعمل شق في جلد الرقبة بالقرب من القصبة الهوائية باستخدام مشرط.
   4. افتح الجلد لكشف الغدد اللعابية. افصل الغدد اللعابية باستخدام الكماشة لفضح العضلة القصية اللهاية. شق العضلات حول القصبة الهوائية باستخدام الكماشة لكشف القصبة الهوائية.
   5. ضع خيطا قطنيا تحت القصبة الهوائية باستخدام الكماشة.
   ثقب
   6. منتصف القصبة الهوائية المكشوفة بعناية بين حلقتين غضروفيتين بإبرة 26 جراما. احرص على عدم إتلاف القصبة الهوائية أكثر من ذلك.
   7. أدخل القسطرة حوالي 0.5 سم في القصبة الهوائية. تأكد من عدم إدخال القسطرة بعيدا جدا في القصبة الهوائية ، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى تلف بنية الرئة.
   8. قم بتثبيت القسطرة عن طريق ربط القصبة الهوائية حول القسطرة باستخدام خيط القطن الموضوع في الخطوة 2.1.5. إذا لم يتم ربط القسطرة بشكل كاف ، فقد يتدفق محلول الملح المتوازن المحقون نحو الجزء العلوي من الجهاز التنفسي بدلا من النزول إلى الرئتين.
2. اجمع سائل الغسيل
   1. قم بتحميل حقنة سعة 1 مل ب 1 مل من محلول الملح المعقم المتوازن مع 100 ميكرومتر EDTA.
   2. قم بتوصيل المحقنة سعة 1 مل بالقسطرة وحقن محلول الملح / EDTA برفق في الرئة.
   3. استنشق المحلول برفق أثناء تدليك الصدر بالفأر. إذا لم يكن سائل الشفط مرئيا في المحقنة ، فأدخل القسطرة بحذر لأسفل أو أعلى القصبة الهوائية.
   4. قم بإزالة المحقنة من الإبرة وانقل سائل الغسيل المستعاد إلى أنبوب سعة 15 مل يوضع على الثلج. عادة ، يتم استرداد 700 - 900 ميكرولتر من BAL من 1 مل من المحلول المحقون.
   5. كرر الخطوات 2.2.1 - 2.2.4 مرتين أخريين.
      ملاحظه: إذا كان الغرض هو تحليل المحتوى غير الخلوي ، فمن المستحسن تركيز العينات المجمعة عند وجود مشكلات في الحساسية.

3. جمع المكونات الخلوية وغير الخلوية لسائل BAL

1. جهاز الطرد المركزي لسائل الغسيل لمدة 7 دقائق عند 400 × جم و 4 درجات مئوية.
2. اجمع المادة الطافية واستخدمها على الفور لمزيد من التحليل (على سبيل المثال ، مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ، ELISA) أو قم بالتجميد عند -80 درجة مئوية. احتفظ بحبيبات الخلية لتحليل التدفق الخلوي في الرئتين.
3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل ACK. < / > ملاحظه: تضمن هذه الخطوة تحلل كريات الدم الحمراء مع الحفاظ على خلايا الدم البيضاء سليمة.
4. احتضان لمدة 2 دقيقة في RT.
   ملاحظه: لتقليل التباين الناجم عن تحلل الخلايا الحمراء ، لا ينبغي تنفيذ هذه الخطوة لمدة تزيد عن دقيقتين.
5. أضف 1 مل من PBS البارد لتخفيف المخزن المؤقت للغسيل ACK.
6. جهاز الطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 400 × جم و 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في حجم مناسب من PBS لتحليل المصب (انظر أدناه).
   ملاحظه: يعتمد حجم PBS على الدراسة النهائية التي سيتم إجراؤها.

< p class = "jove_title" >4. تحليل أنواع الخلايا المختلفة في سائل BAL عن طريق قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: يتمثل أحد الاحتمالات في تحليل التركيب الخلوي المطلق والنسبي لسائل BAL عن طريق إجراء قياس التدفق الخلوي. الهدف من هذه الورقة هو توضيح تقنية BAL. قياس التدفق الخلوي هو تقنية متخصصة في حد ذاتها. يوصى بقراءة الأوراق المتخصصة حول تقنية قياس التدفق الخلوي. يتم استخدام الأجسام المضادة المقترنة بالفلوروفور التي تتعرف على المستضدات السطحية (انظر الجدول 1) الخاصة بنوع (أنواع) خلايا معينة. باستخدام استراتيجية البوابات ، من الممكن تحديد الخلايا التائية ، والضامة ، والخلايا المتغصنة ، والخلايا البائية ، والحمضات ، والعدلات في جزء الخلية من BAL.

1. تلطيخ سطح الخلية
   ملاحظه: من المهم تضمين جميع الضوابط الهامة لتحليل قياس التدفق الخلوي. هناك حاجة إلى ثلاث مجموعات من الأنابيب (انظر الجدول 2): (1) أنابيب تحتوي على العينات. (2) أنابيب بها خلايا BAL لكل جسم مضاد فلوروفور لعمل بقع مفردة ؛ هذا يسمح بتحديد الفولتية لكل قناة على مقياس التدفق الخلوي ؛ و (3) أنابيب بها حبات لكل جسم مضاد فلوروفور لعمل بقع مفردة ؛ هذا لتحديد مصفوفة التعويض.
   1. اصنع مزيجا من الأجسام المضادة وكتلة Fc (مضاد CD16 / CD32) في PBS عند التخفيفات المناسبة (انظر الجدول 2). من الضروري تحديد تخفيف العمل الأمثل لكل جسم مضاد قبل التجربة.
   2. أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة للعينة وأضف 50 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف بشكل مناسب إلى عناصر التحكم الحرجة.
      ملاحظه: يمكن إجراء التلوين في لوحة 96 بئرا على شكل حرف U. هذا يجعل من الممكن تقليل حجم البقعة بسهولة وتشغيل كميات كبيرة من العينات.
   3. احتضن لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية.
   4. جهاز طرد مركزي لمدة 7 دقائق عند 400 × جم و 4 درجات مئوية.
   5. أعد تعليق الخلايا في PBS إلى حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر.
      ملاحظه: يعتمد هذا الحجم النهائي على الحد الأدنى من الحجم الذي يمكن لمقياس التدفق الخلوي الوصول إليه. يمكن أن يختلف هذا قليلا بين الآلات. بالإضافة إلى ذلك ، يعتمد حجم القراءة على عدد الخلايا و / أو الوقت الذي ستستغرقه العينة للتشغيل في مقياس التدفق الخلوي.
   6. استخدم العينات وعناصر التحكم لتحليل قياس التدفق الخلوي.
      ملاحظه: لتحديد عدد الخلايا المطلق لمجموعات الخلايا المختلفة ، يجب إضافة حبات العد. أضف نفس عدد الخرزات (± 25,000 خرزة) إلى كل عينة قبل القياس مباشرة. باستخدام مبعثر أمامي وجانبي ، يمكن تحديد حبات العد عن طريق قياس التدفق الخلوي (انظر الشكل 1). بعد ذلك ، يمكن حساب العدد المطلق للخلايا في العينة من خلال مقارنة نسبة أحداث الخرزة إلى أحداث الخلية. يمكن استخدام الصيغة التالية:
      
2. تحليل قياس التدفق الخلوي
   ملاحظه: يجب إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي فور الانتهاء من بروتوكول التلوين. يجب استخدام مقياس التدفق الخلوي مع الليزر والمرشحات المناسبة للكشف عن الإشارة. يقدم الجدول 3 نظرة عامة على الليزر والمرشحات اللازمة للدراسة الموضحة في هذه المخطوطة. لمزيد من المعلومات حول تحليل قياس التدفق الخلوي ، انظر Adan et al.
   1. قم بإعداد البوابات الأساسية بناء على التشتت الأمامي والجانبي ، باستثناء الحطام والمزدوجات (انظر الشكل 1).
   2. اضبط الجهد والتعويض عن التداخل الطيفي بمساعدة الخلايا والخرز أحادي الملطخ.
      ملاحظه: تختلف هذه الإعدادات لكل مقياس تدفق خلوي وتحتاج إلى فحصها قبل كل تجربة. لتحليل التدفق الصحيح ، تعتبر الفولتية المبعثرة الأمامية والجانبية أمرا بالغ الأهمية. يمكن أن يساعد التشتت الأمامي والجانبي الصحيح في تحديد هوية الخلايا التي تم تحليلها وتأكيدها. لتحديد هذه الفولتية ، يجب تشغيل عينة غير ملوثة أولا.
   3. قم بإعداد بوابات مضان للمستضد السطحي (انظر الشكل 1) وقم بتحليل العينات.

الجدول 1: اختيار مستضدات سطح الخلية المناعية. يوفر هذا الجدول قائمة بالحلقات السطحية المستخدمة لتوصيف أنواع الخلايا المختلفة. ستكون هناك حاجة إلى مجموعات من عدة علامات لتحديد نوع خلية معين بشكل موثوق.

مستضد نوع الخلية مجموعة التمايز 3 (CD3) معبرا عنها على الخلايا التائية مجموعة التمايز 11 ج (CD11c) تعبير عال في معظم الخلايا المتغصنة ، ولكن أيضا على الخلايا الوحيدة والضامة والعدلات وبعض الخلايا البائية. مجموعة التمايز 11 ب (CD11b) يتم التعبير عنها على سطح العديد من الكريات البيض بما في ذلك الخلايا الوحيدة والعدلات والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا الحبيبية والضامة. سيجليكف البلاعم السنخية واليوزينيات. MHCII توجد عادة فقط في الخلايا العارضة للمستضد مثل الخلايا المتغصنة والخلايا البلعمية أحادية النواة والخلايا البائية. CD19 مستضد الخلايا الليمفاوية البائية لاي 6 جي علامة للخلايا الوحيدة والخلايا الحبيبية والعدلات < p class = "jove_content" > الجدول 2. قائمة الضوابط التي سيتم تضمينها. يبين هذا الجدول جميع الضوابط اللازمة للتفسير الدقيق للنتائج التي تم الحصول عليها. العينات أنبوب يضاف المستضد الفلوروفور إلى الخلايا تركيز مخزون الأجسام المضادة (ملغم / مل) تخفيف الأجسام المضادة الحجم الكلي (ميكرولتر) صبغة قابلة للإصلاح 0.2 1/1000 50 CD11c 0.2 1/800 50 سيجليكف 0.2 1/100 50 عينة X MHCII 0.2 1/200 50 CD3 0.2 1/200 50 CD19 0.2 1/200 50 CD11b 0.2 1/200 50 لاي 6 جي 0.2 1/200 50 ضوابط الجهد أنبوب يضاف المستضد الفلوروفور إلى الخلايا تركيز مخزون الأجسام المضادة (ملغم / مل) تخفيف الأجسام المضادة الحجم الكلي (ميكرولتر) الخلايا غير الملوثة / / / 50 خلايا أحادية الملطخة صبغة قابلة للإصلاح 0.2 1/1000 50 خلايا أحادية الملطخة CD11c 0.2 1/800 50 خلايا أحادية الملطخة سيجليكف 0.2 1/100 50 خلايا أحادية الملطخة MHCII 0.2 1/200 50 خلايا أحادية الملطخة CD3 0.2 1/200 50 خلايا أحادية الملطخة CD19 0.2 1/200 50 خلايا أحادية الملطخة CD11b 0.2 1/200 50 خلايا أحادية الملطخة لاي 6 جي 0.2 1/200 50 ضوابط التعويض أنبوب يضاف المستضد الفلوروفور إلى الخرز تركيز مخزون الأجسام المضادة (ملغم / مل) تخفيف الأجسام المضادة الحجم الكلي (ميكرولتر) الخرز غير الملوثة / / / 200 ريال حبات أحادية اللون CD11c 0.2 1/2000 200 ريال حبات أحادية اللون سيجليكف 0.2 1/2000 200 ريال حبات أحادية اللون MHCII 0.2 1/200 200 ريال حبات أحادية اللون CD3 0.2 1/2000 200 ريال حبات أحادية اللون CD19 0.2 1/2000 200 ريال حبات أحادية اللون CD11b 0.2 1/400 200 ريال حبات أحادية اللون لاي 6 جي 0.2 1/200 200 ريال

الجدول 3: نظرة عامة على الليزر والمرشحات الخاصة بمقياس التدفق الخلوي المستخدم في هذه الدراسة.

نوع الليزر إعداد الفلتر 505 ليرة لبنانية 525/50 أزرق (488 نانومتر) 550 ليرة لبنانية 575/26 100 ميجاوات 670 ليرة لبنانية 685/35 750 ليرة لبنانية 780/60 البنفسجي 405 نانومتر 450/50 100 ميجاوات أحمر 633 نانومتر 660/20 70 ميغاواط 750 ليرة لبنانية 780/60

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: استراتيجية البوابات للكشف عن التدفق الخلوي للضامة والخلايا المتغصنة والخلايا التائية والخلايا البائية والعدلات والحمضات في سائل BAL. تم عزل خلايا BAL باستخدام بروتوكول BAL الموصوف. تم عزل الخلايا من الفئران بعد 24 ساعة من تقطير عديدات السكاريد الدهنية داخل القصبة الهوائية. تم تحديد عد الخرز والخلايا بناء على خصائص التشتت الأمامي والجانبي. في بوابة الخلية ، تم تحديد الخلايا المفردة...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات محلول ملح متوازن ثيرمو فيشر العلمي 14175-129 حمض الخليك إيثيل ينديامين تترا سيجما ألدريتش E6511 مزعجه 23 جم × 1 1/4 إبرة هينكي ساس وولف 4710006030 الحجم: 0,60 × 30 ملم 26 جم × 1/2 نيلدا هينكي ساس وولف 4710004512 الحجم: 0،45 * 12 ملم أنابيب بلاستيكية BD التكنولوجيا الطبية 427411 أنابيب البولي إيثيلين ، معرف 0.58 مم (.023 بوصة) OD. 965 مم (0.38 بوصة) 30.5 م (100 بوصة) البنتوباربيتال الصوديوم كيلا نيفادا 514 محلول ملحي مخزن بالفوسفات لونزا BE17-516F PBS بدون Ca ++ Mg ++ أو أحمر الفينول ؛ مفلتر معقم محاقن 1 مل هينكي ساس وولف 5010.200 فولت 0 غير حراري وغير سام ملقط أدوات العلوم الجميلة GmbH 91197-00 مقص جراحي أدوات العلوم الجميلة GmbH 91460-11 أنبوب الطرد المركزي 50 مل ال. جيير 7696705 خال من الرناس / دنازي / السموم الداخلية أنبوب الطرد المركزي 15 مل ال. جيير 7696702 خال من الرناس / دنازي / السموم الداخلية أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1,5 مل سيجما ألدريتش 0030 120.094 روبلين أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سيجما ألدريتش 5415 ص الطرد المركزي ثيرمو فيشر العلمي 75004030 محلول التحلل من الأمونيوم وكلوريد البوتاسيوم (ACK) لونزا 10-548 ه معقمة تصفية حي / ميت -efluor506 العلوم الحيوية 65-0866-18 صبغة قابلة للإصلاح CD11c-PE-cy7 العلوم البيولوجية الإلكترونية 25-0114-81 سيجليكف-بي إي BD Pharmingen 552126 MHCII-APCefluor780 بيوليجند 107628 CD3-PE-cy5 VWR 55-0031-U100 CD19-PE-cy5 العلوم البيولوجية الإلكترونية 15-0193-83 CD11b-V450 BD Pharmingen 560455 Ly6G-AF700 بيوليجند 127621 حبات العد المطلق لايف تكنولوجيز أوروبا بي في سي 36950 مضاد ل CD16 / CD32 BD Pharmingen 553142 لوحة تخزين 96 بئر 340 ميكرولتر صقر 353263 V-bottom ، بولي بروبيلين طبيعي مقياس التدفق الخلوي BD Biosciences قسطر BD Biosciences 393202