اختبار الفحم أجار ريزازورين لتقييم نشاط مركب الاختبار ضد البكتيريا الفطرية

الملخص

المصدر: Gold ، B. et al. ، تصور مقايسة Charcoal Agar Resazurin لتعداد البكتيريا الفطرية شبه الكمي والمتوسط الإنتاجية. J. Vis. Exp. (2016)

يعرض هذا الفيديو اختبار Charcoal Agar Resazurin Assay (CARA) لتقييم نشاط المركبات المضادة للميكروبات ضد المتفطرة السلية. يساعد CARA في تقييم فعالية هذه المركبات من خلال قياس تأثيرها على نمو البكتيريا والتمييز بين التأثيرات المضادة للجراثيم والجراثيم.

البروتوكول

1. إعداد فحوصات MIC₉₀ المتماثلة وغير المتماثلة

1. تلقيح M. السل ، M. bovis BCG أو M. smegmatis في OD₅₈₀ من 0.01-0.1 والتوسع إلى منتصف مرحلة السجل (OD₅₈₀ ~ 0.5) في Middlebrook 7H9-ADN (Middlebrook 7H9 يحتوي على 0.2٪ جلسرين ، 0.2٪ سكر العنب ، 0.5٪ ألبومين ، و 0.085٪ كلوريد الصوديوم) أو 7H9-OADC (ميدلبروك 7H9 يحتوي على 0.2٪ جلسرين و 10٪ مكمل OADC).
2. تنمو M. tuberculosis و M. bovis BCG ك~ 20 مل من المزارع الدائمة في قوارير زراعة الخلايا و M. smegmatis مع الاهتزاز في البولي بروبيلين دائري القاع (ثقافة 4 مل) أو 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية (10-20 مل مزرعة). احتضان البكتيريا الفطرية المسببة للأمراض عند 37 درجة مئوية مع 20٪ O₂ و 5٪ CO₂ ، و M. smegmatis عند 37 درجة مئوية مع 20٪ O₂.
3. قم بإعداد تجربة على غرار الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC90) في ظل ظروف النسخ المتماثل وعدم النسخ المتماثل (الشكل 1).
   ملاحظه: عادة ما يتم فحص عوامل الاختبار في نسخ مكررة أو رباعية للسماح باختبار 4 أو 2 من المركبات ، على التوالي ، لكل صفيحة دقيقة 96 بئر. على سبيل المثال ، في لوحة مكونة من 96 بئرا ، يمكن فحص عامل اختبار واحد في الصفوف A-D والآخر في الصفوف E-H. يوجد DMSO (المركبة) في الأعمدة 1 و 2 و 12 ، وتمتد سلسلة تخفيف عامل الاختبار من العمود 3 (أقل تركيز) إلى العمود 11 (أعلى تركيز). عادة ما تستخدم المقايسات على غرار MIC90 سلسلة تخفيف 2 أضعاف. هناك العديد من النماذج غير المتماثلة المتاحة للبكتيريا الفطرية ولأغراض توضيحية ، نستخدم نموذجا متعدد الإجهاد لعدم النسخ المتماثل.
   1. بالنسبة لمقايسة النسخ المتماثل ، قم بتوزيع 200 ميكرولتر من الخلايا في 7H9-ADN عند OD₅₈₀ من 0.01 في جميع الآبار من صفيحة 96 بئرا ذات قاع شفاف ومعالج بثقافة الأنسجة.
   2. بالنسبة للمقايسة غير المتماثلة ، اغسل الخلايا مرتين في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 0.02٪ tyloxapol ، وأعد تعليق الخلايا في وسط غير متكاثر (0.05٪ KH₂PO₄ ، 0.05٪ MgSO₄ ، 0.005٪ سترات الأمونيوم الحديديك ، 0.0001٪ ZnCl₂ ، 0.1٪ NH₄Cl ، 0.5٪ BSA ، 0.085٪ كلوريد الصوديوم ، 0.02٪ تايلوكسابول ، 0.05٪ زبدات ؛ تم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 5.0 مع 2 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم).
      قم
      1. بتخفيف الخلايا إلى OD₅₈₀ من 0.1 في وسط غير مكرر وأضف NaNO₂ من مخزون 1 M محضر حديثا إلى تركيز نهائي قدره 0.5 مليمتر.
      2. قم بتوزيع 200 ميكرولتر خلية عند OD₅₈₀ من 0.1 في جميع الآبار من صفيحة 96 بئرا ذات قاع شفاف ومعالج بزراعة الأنسجة.
         ملاحظه: قم بإعداد التخفيفات المركبة كمحاليل مخزون 100 ضعف في DMSO. وبالتالي ، فإن لوحة MIC النموذجية التي تختبر تأثير الجزيء بتركيز نهائي من 0.4-100 ميكروغرام / مل تتطلب محاليل مخزون من 0.04-10 مجم / مل في DMSO.
   3. أضف 2 ميكرولتر من تخفيفات عامل الاختبار 1 في الصفوف A-E و 2 ميكرولتر من تخفيفات عامل الاختبار 2 في الصفوف E-H. تخلط جيدا.
   4. أضف 2 ميكرولتر للتحكم في السيارة (عادة DMSO) في آبار التحكم ، الأعمدة 1 ، 2 ، 12 (الصفوف A-H). تخلط جيدا.
   5. لكل تجربة ، قم بتضمين عنصر تحكم إيجابي واحد على الأقل مثل ريفامبيسين من 0.004 إلى 1 ميكروغرام / مل (مقايسة التكرار) و / أو 0.08 إلى 20 ميكروغرام / مل (اختبار غير مكرر).
      ملاحظه: يوصى باستخدام 6-bromo-1H-indazol-3-amine9 عند 0.1 إلى 25 ميكروغرام / مل كمركب تحكم له نشاط انتقائي يعتمد على NaNO2 في نموذج الإجهاد المتعدد لعدم النسخ المتماثل.
   6. لتكرار المقايسات ، قم باحتضان الصفائح الدقيقة عند 37 درجة مئوية عند 20٪ O₂ و 5٪ CO₂ لمدة 7 أيام (M. tuberculosis و M. bovis BCG) أو 1-48 ساعة (M. smegmatis). بالنسبة لنموذج الإجهاد المتعدد لعدم التكرار ، احتضان الصفائح الدقيقة لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية عند 1٪ O₂ و 5٪ CO₂ (M. tuberculosis و M. bovis BCG).

فئة < p = "jove_title" >2. تلقيح ألواح CARA

الدقيقة

1. في النقاط الزمنية التي سيتم فيها استخدام CARA كقراءة، قم بإعادة تعليق محتويات البئر بعناية للوحة الفحص على غرار MIC90 باستخدام ماصة p200 متعددة القنوات مضبوطة على 50-75 ميكرولتر.
2. انقل 10 ميكرولتر من محتويات بئر الفحص إلى صفيحة CARA. تأكد من أن ترتيب محتويات البئر على لوحة الفحص يطابق ترتيب محتويات البئر في صفيحة CARA الدقيقة. تجنب الرش أثناء عمليات النقل وتأكد من رصد 10 ميكرولتر في منتصف آبار الصفيحة الدقيقة CARA. تأكد من امتصاص 10 ميكرولتر في صفيحة CARA.
   ملاحظه: لا توجد تخفيفات مطلوبة قبل اكتشاف الخلايا على ألواح CARA الدقيقة.
3. اربط أكوام من ألواح CARA الدقيقة بشريط صفيحي ثم ضعها في كيس بلاستيكي قابل لإعادة الإغلاق. احتضان صفائح CARA الدقيقة عند 37 درجة مئوية مع 20٪ O₂ (M. smegmatis) أو 1٪ O₂ و 5٪ CO₂ (M. tuberculosis و M. bovis BCG).
4. بالنسبة إلى M. tuberculosis و M. bovis BCG ، فحوصات التكرار: احتضان لمدة 7 أيام ؛ بالنسبة لمقطعية السل و M. bovis BCG غير المكتسرة ، احتضان لمدة 10 أيام ؛ بالنسبة إلى M. smegmatis ، المقايسات المتماثلة ، احتضان لمدة 1-2 أيام ؛ بالنسبة إلى M. smegmatis ، المقايسات غير المتماثلة ، احتضان 2-3 أيام><. ملاحظة: الأوقات هي تقديرات ويمكن تعديلها وفقا لذلك لظروف النسخ المتماثل وعدم التكرار والإجهاد المختلفة.

< p class = "jove_content" >3. تطوير صفائح CARA الدقيقة

1. قم بتطوير الصفائح الدقيقة CARA عندما يكون فيلم النمو البكتيري ، أو المستعمرات العيانية الأكبر ، مرئيا على آبار التحكم السلبية (المركبة).
   ملاحظه: بعد الحضانة المطولة ، غالبا ما تظهر آبار الصفيحة الدقيقة CARA جافة ونوصي بترطيب محتويات البئر مسبقا باستخدام PBS المعقم. يعمل هذا على منع الفحم من امتصاص الريزازورين ، مما قد يؤدي إلى انخفاض التألق أو التباين من البئر إلى البئر.
2. باستخدام مجموعة واحدة من 12 طرف p200 مع ماصة متعددة القنوات ، قم بتوزيع 40 ميكرولتر من PBS المعقم على طول جانب الآبار واسمح ل PBS بالتوزيع عبر الجزء العلوي من المستعمرات الدقيقة / البكتيرية.
3. تحضير كاشف تطوير CARA عن طريق خلط 5 ملغ ريزازورين (0.01٪ نهائي) و 50 مل من 5٪ توين -80 في PBS. دوامة ومرشح معقم.
   ملاحظه: يمكن تحضير كاشف تطوير CARA بديل عن طريق خلط محلول سائل الريزازورين المحضر تجاريا عند 1: 1 (حجم / حجم) مع 10٪ Tween80 في PBS.
4. أضف 50 ميكرولتر من كاشف تطوير CARA المحضر حديثا إلى كل بئر من صفيحة CARA الدقيقة باستخدام ماصة ذات 12 قناة. صفائح صخرية ذهابا وإيابا عدة مرات للمساعدة في توزيع الكواشف عبر الأجار والحصيرة البكتيرية في كل بئر.
5. ضع الألواح في كيس بلاستيكي قابل لإعادة الإغلاق واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل للمفطرة اللطخية و 45-60 دقيقة للمفطرة السلية أو M. bovis BCG.
   ملاحظه: إذا فشلت آبار التحكم في السيارة في التحول إلى اللون الوردي خلال الساعة الأولى ، فيمكن إعادة تعبئة الألواح واحتضانها لفترات أطول من الوقت.
6. قبل قراءة التألق ، ضع ألواح CARA الدقيقة في غطاء للسلامة الحيوية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إزالة أغطيةها. عند استخدام مقاييس الطيف الضوئي BSL3 خارج خزانة السلامة الحيوية ، قم بلصق ملصق PCR عالي الجودة البصرية على اللوحة وأغلقها بإحكام عن طريق الضغط برفق على سطح الملصق بمنشفة ورقية ناعمة.
7. حدد التألق عبر القراءة العلوية مع الإثارة عند 530 نانومتر والانبعاث عند 590 نانومتر. ليس من الضروري إفراغ اللوحة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تخطيطي لمرق مقايسة MIC₉₀ و CARA مع النتائج المتوقعة. يتم عرض كل من نتائج MIC₉₀ و CARA ل 8 أنشطة محتملة. الترميز اللوني لآبار الصفائح الدقيقة MIC₉₀ أبيض (بدون نمو) وبني (نمو) ، وبالنسبة للألواح الدقيقة CARA أسود (بدون تألق) ووردي (مضان ريسوروفين). البيانات افتراضية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ميدلبروك 7H9 بيكتون ديكنسون هاتف: 271310 ميدلبروك 7H11 بيكتون ديكنسون هاتف: 298810 ميدلبروك OADC بيكتون ديكنسون 212351 BSA ، صدمة حرارية روش 3118958001 الفحم المنشط سيغما PBS و Dulbecco's Ca2 + و Mg2 + مجانا تقنيات الحياة / Invitrogen 14190-144 توين 80 سيغما ص 8074 ريفامبيسين سيغما R3501 6-برومو-1H-إندازول-3-أمين ألفا إيسار إتش34095 فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة سيغما ب0662 كبريتات المغنيسيوم ، سباعي الهيدرات سيغما M1880 سترات الأمونيوم الحديديك سيغما F5879 كبريتات الزنك ، سباعي الهيدرات سيغما Z0251 كلوريد الأمونيوم سيغما أ 9434 حمض الزبد ، سائل سيغما B103500 مسحوق ريزازورين سيغما R7017 كلوريد الصوديوم جي تي بيكر 4058-01 محلول ريزازورين محضر إنفيتروجين DAL1100 مقياس الطيف الضوئي الأجهزة الجزيئية م 5 96 بئر ، صفائح دقيقة معالجة بزراعة الأنسجة كورنينج 3595 خزانات الكاشف VWR 89094-678 أكياس بلاستيكية قابلة لإعادة الإغلاق VWR 395-94602 14 مل أنابيب البولي بروبلين المستديرة القاع كورنينج 352059 أنبوب الطرد المركزي المخروطي 50 مل كورنينج 352070 75 سم² قارورة زراعة الخلايا كورنينج 431464 وحدة