اختبار لإشارات عامل النسخ NF-кB/AP-1 المعتمدة على TLR في الضامة

الملخص

المصدر: McKiel, L.A., et al. اختبار خلية مراسل البلاعم لفحص إشارات NF-kB / AP-1 التي تشبه المستقبلات على طبقات البروتين الممتصة على الأسطح البوليمرية. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو فحصا لفحص النشاط المعتمد على المستقبلات الشبيهة بالحصيلة (TLR) لعوامل النسخ العامل النووي كابا-B (NF-κB) والبروتين المنشط -1 (AP-1) في الضامة. تؤدي TLRs إلى سلسلة إشارات مؤيدة للالتهابات عند التعرف على الأنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر (DAMPs) ، مما يؤدي إلى تنشيط NF-κB و AP-1. تنتج البلاعم المراسلة المصممة هندسيا إنزيم الفوسفاتيز القلوي الجنيني المفرز (SEAP) عند تنشيط NF-κB و AP-1 ، والذي يتم اكتشافه عن طريق تفاعل كروموجينيك.

البروتوكول

1. إعداد الوسائط والكواشف

1. تحضير وسائط الخلايا الليفية. امزج 450 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco ، و 50 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، و 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
2. إعداد وسائط نمو البلاعم المراسل في 50 مل. اجمع بين 45 مل من DMEM و 5 مل من FBS و 5 ميكروغرام / مل من كاشف التخلص من الميكوبلازما (جدول المواد) و 200 ميكروغرام / مل من الفليوميسين D1 (جدول المواد). يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
3. إعداد وسائط فحص البلاعم المراسل في 50 مل. امزج بين 45 مل من DMEM ، و 5 مل من FBS المعطلة بالحرارة (HI-FBS) ، و 5 ميكروغرام / مل كاشف التخلص من الميكوبلازما ، و 200 ميكروغرام / مل من الفليوميسين D1. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.

فئة

2. طلاء أسطح زراعة الخلايا ب Poly (ميثيل ميثاكريلات)

1. قم بإذابة بولي (ميثيل ميثاكريلات) (PMMA) في الكلوروفورم عند 20 مجم / مل (على سبيل المثال ، 100 مجم من PMMA في 5 مل من الكلوروفورم) في قارورة تلألؤ زجاجية سعة 20 مل. ضع قضيب تقليب مغناطيسي في القارورة واتركه يقلب لمدة ساعتين على الأقل ، حتى تذوب جميع المواد الصلبة.
   أنذر: الكلوروفورم ضار إذا تم استنشاقه. تأكد من استخدام المذيب في غطاء الدخان أثناء ارتداء قفازات PVA.
2. ماصة 400 ميكرولتر من محلول PMMA على مركز مجهر زجاجي من البورسليكات تنزلق في طلاء تدور ، وتدور بسرعة 3000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. قم بإعداد عدد الشرائح المطلوبة للفحص ، بالإضافة إلى 3-5 شرائح إضافية لقياس زاوية ملامسة الماء. قم بتخزين الشرائح في صندوق نظيف (يتم رشها ومسحها بنسبة 70٪ من الإيثانول) لاستخدامها في المستقبل.
   ملاحظه: غالبا ما يستخدم طلاء الدوران لإيداع طلاء رقيق وموحد على سطح مستو. يقوم جهاز طلاء الدوران بتدوير الركيزة بسرعات عالية ، باستخدام قوة الطرد المركزي لنشر محلول الطلاء على السطح.
   1. قم بقياس زاوية ملامسة الماء في موضعين عشوائيين على سطح الشرائح المطلية الإضافية (أي ، وليس الشرائح المستخدمة لزراعة الخلايا) باستخدام مقياس الزوايا للتأكد من أن السطح الزجاجي مغطى بالكامل بالبوليمر.
      ملاحظة: يجب استخدام الماء ذو النقاء الأعلى فقط (على سبيل المثال ، الزجاج المقطر الثلاثي) لقياسات زاوية ملامسة الماء.
3. في خزانة السلامة البيولوجية (BSC) ، قم بتوصيل آبار لزجة مكونة من 8 غرف بشرائح مطلية ب PMMA باستخدام ملقط معقم واتباع تقنية التعقيم. اضغط بقوة على الجزء العلوي من الآبار اللاصقة للتأكد من أنها متصلة بقوة. احتضن الشرائح بآبار لزجة متصلة عند 37 درجة مئوية طوال الليل لتأمين الختم.
   1. اختبر ختم الآبار اللاصقة عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من الماء من درجة زراعة الخلايا (الخالي من السموم الداخلية) إلى كل بئر. احتضن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 60 دقيقة وتأكد من عدم وجود تسرب قبل المتابعة. استنشق الماء ، مع الحرص على عدم إزعاج طلاء PMMA.
4. قم بإجراء غسلات بالماء الخالية من السموم الداخلية عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من الماء الخالي من السموم الداخلية إلى كل بئر واحتضانها لمدة ساعة واحدة (ثلاث مرات) و 12 ساعة و 24 ساعة قبل الاستخدام لإزالة أي مذيب متبقي.
5. اختبر تركيز السموم الداخلية للشرائح لاستخدامها في زراعة الخلايا. احتضان 200 ميكرولتر من ماء الكاشف الخالي من السموم الداخلية (جدول المواد) في بئر واحد من كل شريحة لمدة 1 ساعة. قم بقياس تركيز السموم الداخلية في المستخلص باستخدام مقايسة السموم الداخلية الكروموجينيك النقطية (جدول المواد).
   ملاحظه: البروتوكول التالي خاص بمجموعة فحص السموم الداخلية المدرجة في جدول المواد.
6. استخدم فقط الماء والمواد الاستهلاكية (مثل أطراف الماصة وأنابيب الطرد المركزي الدقيقة وألواح الآبار) المعتمدة الخالية من البيروجين (أي خالية من السموم الداخلية) لهذا العمل. أيضا ، يجب إزالة الحرارة من أي أواني زجاجية مستخدمة في تحضير الأسطح المطلية بالبوليمر باستخدام التعقيم الحراري الجاف (250 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) قبل الاستخدام. يمكن أن يؤدي قياس السموم الداخلية في محلول الاستخلاص ، كما هو موضح هنا ، إلى التقليل من تقدير السموم الداخلية على سطح المادة. وبالتالي ، يوصى عند تطوير بروتوكول طلاء البوليمر بإجراء تفاعل فحص السموم الداخلية (أي الخطوات 2.6.4-2.6.6 لعينات الاختبار [ماء الكاشف] أو أدوات التحكم في السنبل) مباشرة داخل الآبار التي تحتوي على العينة المطلية لضمان عدم إدخال أي مصادر للسموم الداخلية عن غير قصد في النظام أثناء عملية الطلاء.
   1. أحضر جميع عينات الاختبار (أي المستخلصات) وكواشف فحص السموم الداخلية إلى RT. أعد تكوين الكاشف الكروموجينيك في مخزن الاختبار المخزن المؤقت ومعيار السموم الداخلية في ماء الكاشف ، واتركه يذوب لمدة 5 دقائق ثم حركه برفق قبل الاستخدام. قم بتغطية جميع الزجاجات بغشاء البارافين عندما لا تكون قيد الاستخدام.
   2. قم بإنشاء منحنى تخفيف قياسي من 5 إلى 8 نقاط لمعيار السموم الداخلية يتراوح من الحد الأدنى إلى الحد الأعلى للفحص عن طريق إجراء تخفيف تسلسلي لمعيار السموم الداخلية في ماء الكاشف.
   3. للتحكم في تعزيز أو تثبيط مقايسة السموم الداخلية في عينات الاختبار ، قم بإعداد عنصر تحكم إيجابي (يسمى أيضا التحكم في السنبلة أو العينة المسننة) عن طريق تخفيف كمية معروفة من السموم الداخلية في محلول عينة اختبار غير مستخدمة.
      ملاحظه: يجب أن يكون تركيز التحكم الإيجابي هو نفس تركيز المعيار في منتصف المنحنى القياسي. إذا كانت الكمية المستردة من ارتفاع السموم الداخلية (أي تركيز التحكم الإيجابي مطروحا منه تركيز عينة الاختبار غير المسننة) في حدود 50-200٪ من التركيز الاسمي لارتفاع السموم الداخلية ، فيمكن اعتبار محلول الاستخراج لا يتداخل بشكل كبير مع الفحص.
   4. أضف 50 ميكرولتر من المعايير أو العينات أو أدوات التحكم في السنبلة إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا في نسخ مكررة أو ثلاثية. استخدم ماء الكاشف كعنصر تحكم سلبي.
   5. أضف 50 ميكرولتر من الكاشف اللوني إلى كل بئر. أضف الكاشف بسرعة إلى جميع الآبار. استخدم مؤقتا لتسجيل مقدار الوقت المستغرق لإضافة كاشف إلى جميع الآبار. قم بتغطية اللوحة بختم لاصق واحتضانها عند 37 درجة مئوية (يعتمد وقت الحضانة على الكثير ومذكور في شهادة التحليل المضمنة في مجموعة الكاشف الكروموجينيك). بدلا من ذلك ، تحقق من اللوحة كل 15 دقيقة أثناء الحضانة حتى يتم ملاحظة تغير اللون في جميع الآبار القياسية.
   6. بعد الحضانة ، أضف 25 ميكرولتر من حمض الأسيتيك 50٪ إلى كل بئر (التركيز النهائي 10٪ حمض الأسيتيك لكل بئر) لإيقاف التفاعل. أضف حمض الأسيتيك بنفس ترتيب إضافة الكاشف الكروموجيني. اقرأ امتصاص اللوحة باستخدام قارئ اللوحة عند 405 نانومتر. استنشق السائل وتخلص من اللوحة.
      ملاحظه: يجب أن تستغرق إضافة حمض الخليك نفس المدة الزمنية لإضافتها إلى كل بئر كما استغرق الكاشف الكروموجينيك (± 30 ثانية).
7. الأشعة فوق البنفسجية (UV) - تعقيم الشرائح لمدة 30 دقيقة قبل تجارب زراعة الخلايا.

< p class = "jove_title" >3. صنع Lysate من خلايا 3T3

1. قم بزراعة خلايا 3T3 في قوارير T150 متعددة إلى التقاء 70٪. لفصل الخلايا ، شفط الوسائط ، اغسل السطح ب 5 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ، وشفط PBS. أضف 5 مل من إنزيم تفكك الخلايا المؤتلف الخالي من أصل حيواني (جدول المواد) واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
2. افصل الخلايا عن طريق إمالة القارورة برفق للخلف وللخلف. أضف 5 مل من PBS لتحييد الإنزيم المؤتلف المستخدم في تفكك الخلايا. انقل الخلايا المنفصلة من القوارير إلى أنبوب طرد مركزي واخلطها عن طريق سحب العينات. قم بإجراء تعداد الخلايا الحية باستخدام مقياس كثافة الدم وصبغة بقاء الخلية.
   ملاحظه: تم اختيار إنزيم تفكك الخلايا الذي يمكن تحييده من خلال التخفيف في PBS لتجنب إدخال البروتينات القائمة على المصل في تحضير المحلل. إذا تم استخدام التربسين لفصل الخلايا ، فيجب تحييده بمحلول يحتوي على المصل ، ويجب إجراء غسل PBS إضافي لتقليل كمية بروتينات المصل المنقولة إلى مستحضر المحلل.
3. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. كرر.
4. الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى عند 200 × جم لمدة 5 دقائق وشفط المادة الطافية. أضف حجم PBS المطلوب لتحقيق تركيز خلية نهائي يبلغ 1 × 10⁶ خلايا / مل. ضع محلول الخلية في فريزر -80 درجة مئوية حتى يتم تجميد العينة بالكامل (2 ساعة على الأقل).
5. قم بإذابة محلول الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية. بمجرد إذابته تماما ، ضع المحلول مرة أخرى في الفريزر -80 درجة مئوية حتى يتجمد تماما. كرر لمدة 3 دورات تجميد وذوبان.
6. قم بإجراء اختبار حمض البيسنكونينيك الصغير (BCA) على محللة الخلية في مجموعة متنوعة من التخفيفات (على سبيل المثال ، 1/100 ، 1/200 ، 1/500 ، 1/1000) لتحديد تركيز البروتين. خفف محللة الخلية إلى تركيز بروتين يبلغ 468.75 ميكروغرام / مل ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
   ملاحظه: تركيز البروتين النهائي في صفيحة 48 بئرا هو 125 ميكروغرام / سم² (بناء على مساحة سطح بئر واحد ، 0.75 سم²).
7. قم بإجراء لطخة غربية لتقييم وجود DAMPs في المحللة (على سبيل المثال ، بروتين الصدمة الحرارية 60 [HSP60] ، مربع مجموعة الحركة العالية 1 [HMGB1]) عن طريق تحميل 40-60 ميكروغرام من بروتين المحللة في عازلة التحميل على جل بولي أكريلاميد بسمك 1.5 مم 10٪ واتبع إجراءات اللطخة الغربية القياسية.

فئة

4. تقييم تأثير طبقات البروتين الممتزة والمستقبلات الشبيهة بالحصيلة على نشاط NF-κB للبلاعم

ملاحظة: للحصول على مخطط لسير العمل التجريبي وتخطيط اللوحة ، راجع الشكل 1A والشكل 2 ، على التوالي.

1. قم بزراعة البلاعم المراسلة في قارورة بحجم مناسب إلى التقاء 70٪. استنشق الوسائط ، واغسل السطح باستخدام PBS ، وشفط PBS. أضف إنزيم تفكك الخلايا المؤتلف واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق.
2. افصل الخلايا عن طريق النقر بقوة على جوانب القارورة. قم بتعطيل إنزيم تفكك الخلايا المؤتلف عن طريق إضافة حجم متساو من وسائط النمو (تحتوي على 10٪ FBS). قم بإجراء تعداد الخلايا الحية باستخدام مقياس كثافة الدم وصبغة بقاء الخلية.
   ملاحظه: الجدوى المتوقعة للبلاعم المراسلة بعد حضانة لمدة 8 دقائق في إنزيم تفكك الخلية هي 90٪.
3. خلايا الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى وإعادة تعليق الخلايا عند 7.3 × 10⁵ خلايا / مل في وسائط الفحص (تحتوي على FBS معطل بالحرارة).
4. افصل تعليق الخلية إلى 3 أنابيب مختلفة: مثبط TLR4 ، ومضاد ل TLR2 ، وغير معالج. احتضان الخلايا بمثبط TLR4 1 ميكروغرام / مل لمدة 60 دقيقة عند RT أو مع 50 ميكروغرام / مل مضاد TLR2 لمدة 30 دقيقة في RT.
5. أضف 200 ميكرولتر من المحللة ، و 10٪ FBS ، و 10٪ بلازما الفأر التجارية (جدول المواد) ، أو خليط من محاليل البروتين إلى صفيحة 48 بئرا (أو ما يعادلها) واترك البروتين يمتص عند 37 درجة مئوية لمقدار الوقت المطلوب (أي 30 دقيقة أو 60 دقيقة أو 24 ساعة). استنشق محاليل البروتين من الآبار ، باستخدام ماصة باستور طازجة لكل محلول بروتين ، واغسل الأسطح ب 250 ميكرولتر من PBS لمدة 5 دقائق. كرر لمدة 3 غسلات.
   ملاحظه: قد تحتاج هذه الخطوة إلى البدء في وقت مبكر في البروتوكول اعتمادا على وقت الامتزاز المطلوب. اضبط البروتوكول وفقا لذلك.
6. بعد فترة الحضانة باستخدام مثبط TLR4 أو مضاد TLR2 ، يتم تعليق خلايا الماصة. أضف 200 ميكرولتر من محلول الخلية إلى كل بئر.
7. بالنسبة لحالة التحكم الإيجابية ل TLR2 ، أضف Pam3CSK4 (Pam3Cys-Ser- (Lys) 4) إلى التركيز النهائي البالغ 150 نانوغرام / مل. بالنسبة لحالة التحكم الإيجابية TLR4 ، أضف عديدات السكاريد الدهنية (LPS) إلى التركيز النهائي البالغ 1.5 ميكروغرام / مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة.
8. عينة 20 ميكرولتر من المادة الطافية من كل بئر وصفيحة مكررة في صفيحة سعة 96 بئرا. قم بتضمين ثلاثة آبار من وسائط الفحص 20 ميكرولتر كعنصر تحكم في الخلفية. أضف 200 ميكرولتر من كاشف فحص مراسل SEAP إلى كل بئر. قم بتغطية اللوحة بختم لاصق واحتضانها لمدة 2.5 ساعة عند 37 درجة مئوية < / > ملاحظه: قد يختلف وقت الحضانة اعتمادا على الظروف التجريبية ، ويجب تحسينه لاختلاف قوي في الامتصاص بين آبار التحكم الإيجابية والسلبية.
   1. انقل ما تبقى من المادة الطافية إلى أنبوب 1.5 مل (لكل بئر). جهاز طرد مركزي عند 1,000 × جم لمدة 10 دقائق لتكسير أي حطام. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل وقم بتخزينه عند -80 درجة مئوية. قم بتحليل المادة الطافية بحثا عن وجود السيتوكينات المسببة للالتهابات (على سبيل المثال ، عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) ، إنترلوكين 6) عن طريق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
9. قم بإزالة ختم اللوحة اللاصقة. اقرأ امتصاص اللوحة باستخدام قارئ اللوحة عند 635 نانومتر. استنشق السائل وتخلص من اللوحة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: طرق ونتائج مقايسة الفوسفاتيز القلوي للبلاعم المراسلة NF-кB / AP-1 على TCPS و PMMA و PDMS و fPTFE. (أ) رسم تخطيطي لسير العمل لمقايسة الفوسفاتيز القلوي للبلاعم المراسل. (ب) لطخة غربية من المحللة تؤكد وجود أنواع DAMP HMGB1 و HSP60 ، مع β-actin كعنصر تحكم في التحميل. (ج) نشاط NF-кB / AP-1 (ممثلة بالامتصاص) للبلاعم المراسلة المزروعة عل...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كواشف زراعة الخلايا مضاد للماوس / الإنسان CD282 (TLR2) بيوليجند 121802 CLI-095 (مثبط TLR4) إنفيفوجين TLRL-CLI95 C57 تكملة البلازما K2 EDTA 10 مل ، درجة مبتكرة من الأصل الأمريكي البحوث المبتكرة IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10 مل بلازما الفأر وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) سيجما ألدريتش D6429-500 مل محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) فيشر ساينتيك 14190250 خال من الكالسيوم ولا المغنيسيوم مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، درجة البحث Wisent 98150 LPS-EK إنفيفوجين TLRL-EKLPS عديد السكاريد الدهني من الإشريكية القولونية K12 الخلايا الليفية NIH / 3T3 ATCC [كرل-1658] بام 3 سي إسك 4 إنفيفوجين TLRL-PMS ببتيد الدهون ثلاثي الأسيل الاصطناعي - TLR1 / 2 ligand البنسلين / الستربتومايسين سيجما ألدريتش P4333-100 مل بلازما إنفيفوجين أنت-إم بي بي بي كاشف القضاء على الميكوبلازما الخلايا الزرقاء الخام إنفيفوجين الخام SP NF-κB / AP-1 خط خلية البلاعم المراسل محلول تريبان أزرق ، 0.4٪ فيشر ساينتيك 15250061 إنزيم TrypLE Express (1X) فيشر ساينتيك 12604021 إنزيم تفكك الخلايا المؤتلف الخالي من الأصل الحيواني زيوسين إنفيفوجين النمل ZN-1 الأطقم والمقايسات لوحات ELISA المطلية مسبقا ، ماوس IL-6 بيوليجند B213022 لوحات ELISA المطلية مسبقا ، ماوس TNF-α بيوليجند B220233 السموم الداخلية (الإشريكية القولونية) - السموم الداخلية القياسية للتحكم (CSE) شركاء شركة كيب كوب E0005-5 السموم الداخلية للمنحنى القياسي في فحص السموم الداخلية الكروموجينيك LAL ماء ، 100 مل شركاء شركة كيب كوب الابيض 1001 يستخدم مع فحص السموم الداخلية الملونة فحص بروتين الأحزمة التسلسلية الدقيقة فيشر ساينتيك PI23235 ليمولوس محللة الخلية الأفريقية (LAL) مجموعة اختبار السموم الداخلية Pyrochrome شركاء شركة كيب كوب C1500-5 كاشف فحص السموم الداخلية الكروموجينيك QUANTI-Blue قلوي الكشف عن الفوسفاتيز إنفيفوجين مندوب QB2 مقايسة الفوسفاتيز القلوي لقياس نشاط NF-κB / AP-1 بشكل غير مباشر كواشف الطلاء البوليمري الكلوروفورم ، اللامائي سيجما ألدريتش 288306-1 لتر الكحول الإيثيلي اللامائي الكحول التجاري P006EAAN سيجما: كاشف الكحول ، لا مائي ، 676829-1L ملقط مستقيم مدبب بأطراف دقيقة فيشر ساينتيك 16-100-113 مذيب فلورينرت FC-40 سيجما ألدريتش F9755-100 مل مذيب مفلور ل fPTFE ماء من درجة زراعة الخلايا (خال من السموم الداخلية) فيشر ساينتيك SH30529LS بولي (ميثيل ميثاكريلات) (PMMA) سيجما ألدريتش 182230-25 جرام مجموعة المطاط الصناعي Sylgard 184 فيشر ساينتيك 50822180 تفلون AF (fPTFE) سيجما ألدريتش 469610-1 جرام بولي [4،5-ثنائي فلورو-2،2-مكرر (ثلاثي فلوروميثيل) -1،3-ديوكسول-كو-رباعي فلورو إيثيلين] المواد الاستهلاكيه أختام الألواح اللاصقة فيشر ساينتيك AB-0580 أنابيب Axygen الدقيقة ، 1.5 مل فيشر ساينتيك 14-222-155 قوارير زجاجية من زجاج البورسليكات ، مع أغطية بيضاء من مادة البولي بروبيلين فيشر ساينتيك 03-337-4 لوحة PS 48 بئر واضحة فيشر ساينتيك 08-772-52 لوحة TCPS 96 بئر شفافة فيشر ساينتيك 08-772-2 ج لوحة TCPS 48 بئر شفافة فيشر ساينتيك 08-772-1 ج غطاء النظارات والدوائر فيشر ساينتيك 12-545-81 قوارير معالجة لزراعة أنسجة الصقر ، T25 فيشر ساينتيك 10-126-10 لزجة الشريحة 8 جيدا المرجع نفسه 80828 شرائح مجهر Superfrost فيشر ساينتيك 12-550-15 قوارير معالجة بزراعة الأنسجة ، T150 فيشر ساينتيك 08-772-48