فحص تحلل الخلايا في المختبر في الوقت الحقيقي لتقييم فاعلية الخلايا التائية CAR

الملخص

المصدر: Xi ، B. et al. ، اختبار الفاعلية في الوقت الفعلي للخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري التي تستهدف الخلايا السرطانية الصلبة والدموية.J. Vis. Exp.(2019)

يوضح هذا الفيديو طريقة لمراقبة نشاط الخلايا التائية CAR ضد الخلايا السرطانية من خلال قياسات المعاوقة الكهربائية في الوقت الفعلي. يقيم تتبع التغييرات في المعاوقة فعالية الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية في تحفيز تحلل الخلايا السرطانية ، مما يوفر نظرة ثاقبة حول قدراتها السامة للخلايا.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. توليد فيروس العدسات المشفر ل CAR

ملاحظة: بمجرد اكتمال بناء بلازميد الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) (CD47 وغيرها) ، يتم إنشاء CARs الفيروسية من خلال الإجراء القياسي ، باستخدام 293 خلية FT ، ومزيج تغليف فيروسي ، وعوامل تعداء (انظر جدول المواد) كما هو موضح. بعد ذلك ، استخدم مجموعة تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (RT-PCR) وجهاز تدوير حراري (انظر جدول المواد) لتحديد عيار الفيروس عن طريق قياس كمية الحمض النووي الريبي الفيروسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. من المهم أن يتم تنفيذ جميع إجراءات الفيروسات العدسية بدقة مع متطلبات السلامة.

1. قم ببذور 15 × 10⁶ خلايا HEK293FT في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco ، واحتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية في طبق واحد 150 مم داخل حاضنة مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂).
2. قم بإعداد أنبوبين سعة 15 مل مع مركب التعداد. يحتوي الأنبوب الأول على الحمض النووي البلازميد الناقل للفيروسات (5 ميكروغرام) ومزيج التعبئة والتغليف الفيروسي (22.5 ميكروغرام) في 2.5 مل من محلول تخفيف التعدين. يحتوي الأنبوب الثاني على 82.5 ميكرولتر من كاشف التعداء في 2.5 مل من محلول تخفيف التعدي (انظر جدول المواد).
3. قم بتحريك محتويات الأنبوب 1 في الأنبوب 2 ، واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
4. انقل محتويات الأنبوب بالتنقيط إلى طبق الخلايا HEK293FT واحتضان العينة طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة بنسبة 5٪ ، ثاني أكسيد الكربون₂.
5. في اليوم التالي ، استبدل الوسط الحالي ب 19 مل من وسط زراعة DMEM الطازج واستمر في احتضان الخلايا طوال الليل داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{المرطبة} بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية.
6. انقل الوسط من الطبق إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. احتفظ بالأنبوب مع الوسط المحتوي على الفيروس في الثلاجة.
7. كرر الإجراء أعلاه ، وأضف DMEM جديدا وجمعه مرة أخرى بعد يوم واحد.
8. اجمع مجموعتين من الوسائط في أنبوب واحد للطرد المركزي. الطرد المركزي للأنبوب عند 2,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
9. نقل معظم المادة الطافية المحتوية على الفيروسات إلى أنبوب طرد مركزي فائق الوضوح. اترك حجما أدنى ، حوالي 1 مل من المادة الطافية لتجنب إزعاج الحبيبات التي قد تحتوي على خلايا و / أو حطام.
10. جهاز طرد مركزي فائق المادة الطافية الموضحة أعلاه عند 110,000 × جم لمدة 100 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
11. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأضف برفق 100 ميكرولتر من وسط DMEM إلى حبيبات الفيروس في الجزء السفلي من الأنبوب. اترك الأنبوب على الجليد لمدة 15 دقيقة. امزج المحلول برفق وقم بتقطيع محلول الفيروس في أنابيب معقمة مبردة مسبقا. قم بتخزين أنابيب مخزون الفيروسات هذه في فريزر -80 درجة مئوية.
12. استخدم مجموعة RT-PCR الكمية لتحديد عيار الفيروس العسسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، الذي يستخرج ويقيس الحمض النووي الريبي الفيروسي.

< p class = "jove_title" >2. توليد وتوسيع الخلايا التائية CAR

1. قم بتنشيط خلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة المجمدة مسبقا (PBMCs) (حوالي 1 × 10⁶ إلى 2 × 10⁶ خلايا) في 1 مل من وسط الخلايا التائية CAR مع عدد متساو من الميكروبيدات المطلية ب CD3 / CD28 (انظر جدول المواد) واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون_لمدة 24 ساعة.
2. قم بإذابة جزء من مخزون فيروس العدسات على الجليد.
3. أضف 1 ميكرولتر من عامل تعزيز التنبيغ في البئر مع الخلايا واخلطه.
4. أضف فيروس العدسات إلى الخلايا بمعدل تعدد من العدوى (MOI) بنسبة 5: 1 واخلطه برفق. في اليوم التالي ، كرر هذه الخطوة (بعد 24 ساعة من التنبيغ الأول).
5. راقب نمو الخلايا التائية كل 2-3 أيام. أضف المزيد من وسط الخلايا التائية CAR الجديد للحفاظ على الخلايا بكثافة 1 × 10⁶ إلى 2 × 10⁶ خلايا / مل.
6. قم بتجميد الخلايا التائية CAR باستخدام بروتوكول قياسي باستخدام محلول تجميد (انظر جدول المواد).
7. قم بإذابة الخلايا التائية CAR باستخدام طريقة قياسية وزراعتها مسبقا في وسط الخلية التائية CAR لمدة ~ 2-4 ساعات مع interleukin-2 ، IL-2 (300 وحدة / مل) قبل تطبيقها على الفحص.

< p class = "jove_title" >3. الكشف عن تعبير CAR عن طريق قياس التدفق الخلوي

1. انقل 3 × 10⁵ خلايا CAR T والخلايا التائية غير المحولة إلى أنبوبين منفصلين للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل.
قم
2. بالطرد المركزي للأنابيب عند 300 × جم لمدة دقيقتين وأعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) الذي يحتوي على مصل بشري بنسبة 1٪.
3. Pipet 100 ميكرولتر من محلول الخلية في أنبوبين من البوليسترين FACS سعة 5 مل واحتفظ بالأنابيب على الجليد لمدة 5 دقائق.
4. أضف 1 ميكرولتر من الماعز المضاد للفأر البيوتينيل F (ab') ₂ إلى أنبوب واحد من كل نوع من أنواع الخلايا. بعد ذلك ، أضف 2 ميكرولتر من فيكوريثرين ، وهو جسم مضاد مضاد للعلامات يحمل علامة PE (انظر جدول المواد) إلى الأنبوب الآخر من كل نوع من أنواع الخلايا. تخلط جيدا وتحتضنها على الثلج لمدة 30 دقيقة.
5. اغسل الخلايا ب 3 مل من عازلة FACS في كل أنبوب وقم بالطرد المركزي للأنابيب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ؛ تخلص من المواد الطافية والدوامة لفترة وجيزة جدا أو هز الأنابيب لفترة وجيزة لإعادة تعليق الخلايا في السائل المتبقي.
6. أضف 2 ميكرولتر من الخلايا العارضة للمستضد (APC) المضادة ل CD3 و 2 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) (انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب. في أنبوب الخلايا الملطخة بمضاد F (ab') ₂ Ab ، أضف 1 ميكرولتر من الستربتافيدين المسمى PE. تخلط لفترة وجيزة وتحتضن الأنابيب على الثلج لمدة 30 دقيقة أخرى.
7. استخدم المخزن المؤقت FACS لغسل الخلايا مرة أخرى كما هو موضح في الخطوة 3.5 وأضف 200 ميكرولتر إضافي من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب.
8. استخدم قياس التدفق الخلوي لتحليل الخلايا عن طريق البوابات أولا على الخلايا التائية في مخطط مبعثر أمامي مقابل مخطط مبعثر جانبي ثم البوابات على الخلايا الحية (7-AAD-سلبي) في مخطط CD3 مقابل 7-AAD. الخطوة الأخيرة هي تحليل مكافحة العلامات أو مكافحة ScFv أو المضادة ل F (ab') ₂ مقابل CD3.

< p class = "jove_title" >4. مقايسة فاعلية التحلل الخلوي في الوقت الحقيقي (RTCA)

ملاحظة: قم بإجراء اختبار RTCA وفقا للشروط الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. باختصار ، قم أولا بوضع الخلايا المستهدفة في آبار الصفيحة الإلكترونية ، متبوعا بإضافة خلايا CAR T في اليوم التالي. تتم مراقبة نشاط التحلل الخلوي لخلايا CAR T ضد الخلايا المستهدفة في الوقت الفعلي. تستخدم الخلايا التائية والخلايا التائية المحولة الوهمية (الخلايا التائية الوهمية CAR) كعناصر تحكم في الخلايا المستجيبة السلبية. يصف البروتوكول التالي مقايسة فاعلية التحلل الخلوي في الوقت الفعلي في المختبر لخطوط الخلايا السرطانية الملتصقة.

1. أضف 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا المستهدفة إلى كل بئر من اللوحة الإلكترونية xCELLigence ، ضع اللوحة داخل أداة xCELLigence ، وقم بقراءة الخلفية. بعد ذلك ، انقل اللوحة الإلكترونية إلى غطاء مزرعة الأنسجة لبذر الخلايا.
2. استخدم بروتوكولا قياسيا لتربسين الخلايا السرطانية المستهدفة من جهاز المزرعة. ثم انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وأضف وسط ثقافة طازج ، حتى 15 مل. حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 5 مل من الوسط الطازج ، واستخدم ماصة مصلية لإعادة تعليق حبيبات الخلية برفق. احسب كثافة الخلايا الحية باستخدام مقياس الدم والمجهر.
3. اضبط كثافة الخلية بشكل مناسب ثم أضف 100 لتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من اللوحة الإلكترونية. عادة ما يكون عدد الخلايا المستهدفة حوالي 10,000 خلية / بئر لخطوط الخلايا الملتصقة (BxPC3 و Hela-CD19 و SKOV3) ، أو 30,000 خلية / بئر لخلايا المعلقة مثل راجي (انظر أدناه للحصول على تفاصيل حول الطلاء المسبق للآبار بالأجسام المضادة من أجل ربط الخلايا السرطانية السائلة).
قم
4. بموازنة اللوحة الإلكترونية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا بالاستقرار بالتساوي في قاع البئر (هذا أمر بالغ الأهمية ؛ لا تتخطى هذه الخطوة).
5. ضع اللوحة الإلكترونية في أداة xCELLigence داخل حاضنة زراعة الخلايا وابدأ في قياس المقاومة، المعروضة كمؤشر الخلية مقابل الوقت، تلقائيا كل 15 دقيقة.
6. في اليوم التالي ، قم بإعداد الخلايا التائية المستجيب CAR T تأكد من إعداد عناصر التحكم المناسبة (على سبيل المثال ، خلايا CAR T الوهمية ، وخلايا التحكم التائية غير المحولة ، و / أو خلايا CAR T غير ذات الصلة) في وقت مبكر للتأكد من أن جميع الخلايا جاهزة في نفس الوقت. اضبط الخلايا المستجيب وخلايا التحكم على الكثافة المناسبة ، وقم بإعداد التخفيفات التسلسلية لضمان تحقيق نسب E: T المطلوبة عند إضافة 100 ميكرولتر من تعليق خلية المستجيب إلى كل بئر في الخطوة 9.
7. أوقف الحصول على بيانات xCELLigence مؤقتا وأحضر اللوحة الإلكترونية من الحاضنة إلى غطاء لزراعة الخلايا.
8. قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط من كل بئر. تبلغ كمية الوسط المتبقي في كل بئر الآن 100 ميكرولتر.
9. أضف 100 ميكرولتر من الخلايا التائية المستجيب المخفف متسلسلا أو خلايا التحكم الأخرى (أي خلايا CAR T الوهمية) لتحقيق نسب E: T المطلوبة.
10. قم بموازنة اللوحة الإلكترونية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح لخلايا المستجيب بالاستقرار، ثم ضع اللوحة الإلكترونية مرة أخرى في أداة xCELLigence. استئناف الحصول على البيانات.
11. إذا رغبت في ذلك ، في النقاط الزمنية الرئيسية ، يمكن إيقاف الحصول على بيانات xCELLigence مؤقتا وإزالة اللوحة من أجل جمع عينات صغيرة لتحليلها عن طريق المقايسات المتعامدة (أي قياس إنتاج السيتوكين عن طريق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) أو قياس التدفق الخلوي).
12. في تجربة الخلية التائية EGFR-GITR-CD3 CAR ، قم بقياس عائد الإنترفيرون جاما (IFNγ) باستخدام مجموعة ELISA (اتبع تعليمات الشركة المصنعة ؛ انظر جدول المواد).
    ملاحظه فيما يتعلق باستخدام السرطانات السائلة: لاختبار الخلايا السرطانية الدموية غير الملتصقة ، قبل إضافة الخلايا ، يتم طلاء آبار الصفيحة الإلكترونية أولا بجسم مضاد خاص بمستضد يتم التعبير عنه على سطح الخلايا السرطانية. بالنسبة لخط خلايا Raji B ، يتم استخدام كاشف ربط يعتمد على anti-CD40 (انظر مجموعة مقايسة قتل الورم السائل في جدول المواد). فيما يلي إجراء طلاء اللوحة:
13. تمييع كاشف الربط (مضاد CD40) بمخزن مؤقت للربط بتركيز 4 ميكروغرام / مل.
14. من خلال العمل داخل غطاء لزراعة الأنسجة ، أضف 50 ميكرولتر من كاشف الربط المخفف إلى كل بئر من اللوحة الإلكترونية. اترك اللوحة الإلكترونية في درجة حرارة الغرفة أو في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
15. قم بإزالة كاشف الربط واغسل اللوحة الإلكترونية 2x على الأقل باستخدام عازلة الغسيل. في هذه المرحلة ، تكون اللوحة الإلكترونية جاهزة لبذر خلايا راجي المستهدفة (30,000 خلية / بئر).
16. تابع الخطوة 4.1 (أعلاه) لتنفيذ بقية الإجراء.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 7-AAD بيوليجند 420404 Anti-CD40 ، مجموعة فحص قتل الورم السائل ACEA Biosciences 8100005 مناهضة للإنسان F (ab') 2 مختبرات جاكسون للأبحاث المناعية. 109-116-088 APC مضاد ل CD3 بيوليجند 317318 RPMI1640 متوسط الفحص تقنيات الحياة. كورب 11875-093 محلول مجمد للخلايا التائية CAR-T CryostorCS10 تقنيات الخلايا الجذعية #07930 وسيط الخلية التائية CAR-T من ProMab AIM-V + 300IFU / مل IL-2 12055-091 الميكروبيدات المطلية CD3 / CD28 ، Dynabeads ثيرموفيشر 11131 د DMEM GElifesciences.com SH30243.02 مخزن FACS المؤقت صنع بروماب FBS Lonza.com 14-503F HEK293FT ثيرمو فيشر R70007 طقم INFg ELISA ثيرمو فيشر مزيج تغليف العدسات الفيروسية نظام العلوم الحيوية VP100 طقم المعايرة بالتحليل الكمي RT-PCR من Lenti-X (Clontech) تاكارا 631235 وسيط Promab للخلايا المستهدفة متنوعة مع خطوط الخلايا محلل خلوي في الوقت الحقيقي ACEA Biosciences دورة حرارية ثيرمو فيشر عامل تعزيز التنبيغ ، محسن نقل الفيروسات (Alstem) ترانسبلس ، الstem في 020 حل تخفيف التعداء ، Opti-MEM ثيرمو فيشر كاشف النفقة ، كاشف NanoFect العلم تف 100