طريقة في المختبر لتحديد النشاط المضاد لموت الخلايا المبرمج للأجسام المضادة ضد TNFα

الملخص

المصدر: Tierrablanca-Sánchez, L., et al. تحديد الفاعلية النسبية للجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد لعامل نخر الورم (mAb) عن طريق تحييد عامل نخر الورم باستخدام طريقة التحليل الحيوي في المختبر. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تقنية لتقييم فعالية الأجسام المضادة ضد عامل نخر الورم ألفا (TNFα) ، وهو سيتوكين التهابي ، من خلال نهج التحليل الحيوي في المختبر. TNFα ، عند إدخاله إلى الخلايا المجهدة ، يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. ومع ذلك ، فإن الارتباط بالأجسام المضادة يحد من TNFα ، مما يتجنب موت الخلايا المبرمج. يتم قياس درجة موت الخلايا المبرمج باستخدام مقايسة التلألؤ البيولوجي.

البروتوكول

1. إعداد الوسائط والحلول

1. تحضير وسط الاستزراع: RPMI-1640 مع 10٪ مصل بقري للجنين (FBS) ، درجة الحموضة 7.4.
2. تحضير وسط ثقافة الفحص: RPMI-1640 بدون فينول أحمر ولكن مع 1٪ FBS ، درجة الحموضة 7.4.
3. تحضير محلول غسيل الخلايا: محلول ملحي مخمن المغنيم والكالسيوم من Dulbecco مع 0.02٪ EDTA ، درجة الحموضة 7.4.
4. تحضير محلول انفصال الخلية: 0.125٪ تربسين مع 1 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA).
   1. قم بإذابة 100 مل من محلول 0.25٪ من التربسين-EDTA ونقله إلى قارورة معقمة سعة 500 مل.
   2. امزج مع 100 مل من محلول غسيل الخلايا وقم بتوزيع 15 مل من الكميات في أنابيب معقمة سعة 15 مل. يحفظ في درجة حرارة -70 إلى -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
   3. قم بتصفية هذه المحاليل من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر وقم بتسخينه حتى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
5. تحضير محلول مخزون موت الخلايا المبرمج التعريفي محلول TNFα عند 3.3 ميكروغرام / مل.
   1. قم بإذابة 20 ميكروغرام من TNFα مع 500 ميكرولتر من الماء المعقم بالفلتر في عبوته الأولية واخلطه حتى الذوبان الكامل.
   2. انقله إلى أنبوب معقم سعة 15 مل وأضف 5.5 مل من محلول DPBS الخالي من المغنيم والكالسيوم إلى هذا الأنبوب. تخلط برفق باستخدام خلاط دوامة.
   3. اقسم المحلول إلى 70 ميكرولتر. قم بتوزيع كل حصة في أنابيب دقيقة سعة 0.5 مل وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
6. تحضير محلول تحريض موت الخلايا المبرمج: محلول TNFα عند 40 نانوغرام / مل.
   1. قم بإذابة جزء من محلول مخزون موت الخلايا المبرمج ، واحتضانه في حمام مائي عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   2. قم بتخفيف محلول مخزون تحريض موت الخلايا المبرمج إلى 40 نانوغرام / مل عن طريق إضافة 61 ميكرولتر من محلول TNFα 3.3 ميكروغرام / مل إلى 4.939 مل من وسط زراعة الفحص في أنبوب معقم سعة 15 مل.
   3. تخلط بخلاط دوامة لمدة 10 ثوان ؛ يجب تحضير هذا المحلول طازجا قبل الاستخدام.
   4. قم بتسخين المحلول إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل استخدامه في فحص التحييد.
7. تحضير محلول الركيزة: محلول كاسباز 3/7 جلو.
   1. قم بإذابة محلول كاسباز العازل (كاسباز 3/7 جلو عازل) لمدة 12 ساعة قبل الاستخدام.
   2. دع محلول كاسباز العازل والركيزة (ركيزة كاسباز 3/7 جلو) يجلسان بشكل منفصل عند 25 ± 5 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الخلط.
   3. انقل 10 مل من محلول كاسباز العازل إلى قارورة الركيزة واخلطها عن طريق الانعكاس.
   4. يحفظ في درجة حرارة 25 ± 5 درجة مئوية ، محمي من الضوء حتى الاستخدام.
      ملاحظه: المحلول مستقر لمدة 6 ساعات في درجة حرارة الغرفة.

< p class = "jove_title" >2. زراعة الخلايا والعد

1. ذوبان الخلايا والثقافة الفرعية الأولى.
   1. قم بإزالة قارورة واحدة بها خلايا WEHI 164 من الفريزر عند -80 درجة مئوية وانقلها إلى حمام جليدي.
   2. الماصة لأعلى ولأسفل مع 1 مل من وسط المزرعة الدافئ مسبقا حتى تذوب الخلايا المجمدة تماما.
   3. قم بتوزيع 9 مل من وسط الاستزراع المسخن مسبقا على أنبوب معقم سعة 15 مل.
   4. انقل تعليق الخلية إلى الأنبوب المعقم سعة 15 مل واخلطه برفق خمس مرات عن طريق الانعكاس.
   5. الطرد المركزي معلق الخلية عند 125 × جم لمدة 3 دقائق.
   6. أضف 5 مل من وسط الثقافة إلى الأنبوب. امزج حتى يتم تعليق الخلايا تماما.
   7. لعد الخلايا ، انقل 50 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب دقيق سعة 500 ميكرولتر واخلطه مع 50 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان بلو. عد الخلايا واضبطها على 0.5 × 10⁶ خلايا / مل. انظر الخطوة 2.2 أدناه.
   8. أضف 13 مل من وسط المزرعة الدافئ مسبقا إلى قارورة زراعة الخلايا سعة 75 مل.
   9. قم بتوزيع حجم تعليق الخلية الكافي من الخطوة 2.1.6 لتحقيق 0.5 × 10⁶ خلايا / مل في قارورة زراعة الخلية واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ بين عشية وضحاها.
2. عد الخلايا.
   1. باستخدام المحلول من الخطوة 2.1.6 ، انقل 0.05 مل إلى مقياس كثافة الدم وحدد كثافة الخلية تحت المجهر باستخدام استبعاد التربان الأزرق.
   2. تحديد العدد الإجمالي للخلايا والخلايا القابلة للحياة.
   3. اضبط تعليق الخلية على 0.5 × 10⁶ خلايا / مل
      _{V ثقافة الوسط} (مل) =
      _{وسط الثقافة} V (مل) = (5 مل -_{تعليق الخلية} الخامسة) < br / > _{V وسط الثقافة} (مل) = الحجم المعدل لتعليق الخلية WEHI 164
      NVC = عدد خلايا WEHI القابلة للحياة 164 / مل
      _{وسط الثقافة} V (مل) = حجم متوسط لثقافة الفحص المضاف إلى تعليق الخلية لتحقيق 0.5 × 10⁶ خلايا / مل
      0.5 × 10⁶ = كثافة الخلية المستهدفة
3. انفصال الخلية والثقافات الفرعية الثانية والثالثة.
   ملاحظه: يمكن استخدام نظام التفريغ لإزالة المحاليل من القوارير. يمكن استخدام الماصات المعقمة أو الزجاجية التي تستخدم لمرة واحدة. إذا كانت الماصة تحتوي على انسداد قطني في الأعلى ، فيجب إزالتها قبل الاستخدام.
   1. قم بإزالة وسط المزرعة من قارورة T لزراعة الخلايا باستخدام ماصة معقمة سعة 1 مل ومكنسة كهربائية.
   2. ضعي 5 مل من محلول غسيل الخلايا في قارورة T المزروعة ، واخلطيها برفق ، وتخلصي من المحلول. كرر هذه الخطوة مرتين.
      ملاحظه: تعد الإزالة الكاملة لوسط الثقافة أمرا بالغ الأهمية لانفصال الخلايا بكفاءة.
   3. أضف 15 مل من محلول انفصال الخلايا إلى قارورة T واتركها لمدة 3 دقائق في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   4. تحقق من عدم وجود خلايا متصلة في الجدار الداخلي للقارورة تحت المجهر. قم بإزالة الخلايا من قارورة T المزروعة باستخدام ماصة معقمة سعة 20 مل وقم بتوزيعها في أنبوب معقم سعة 50 مل.
   5. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 125 × جم لمدة 3 دقائق.
   6. عد الخلايا وأضف وسيطا مزروقا كافيا للوصول إلى تركيز الخلية المطلوب وفقا للمعادلة 1.
   7. أضف هذا التعليق إلى قارورة T^مقاس 72 سم 2 واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   8. الزراعة الفرعية للخلايا مرتين على الأقل قبل استخدامها في مقايسة التحييد. كرر الخطوات 2.3.1-2.3.8 لليومين التاليين.
4. تعليق خلية الفحص.
   1. حدد ثقافة فرعية WEHI 164 تحتوي على ثلاث تمريرات على الأقل. انظر الخطوة 2.1.
   2. افصل الخلايا وعدها وفقا للخطوتين 2.2 و 2.3 من هذا البروتوكول.
   3. تمييع معلق الخلية وفقا للمعادلة 1 إلى 0.5 × 10⁶ خلايا / مل.
   4. استخدم هذا التعليق الخلوي لمقايسة التحييد. امزج جميع معلقات الخلايا بخلاط دوامة قبل الاستخدام.

فئة

3. تحضير الأجسام المضادة والتخفيفات

1. التقدير الكمي للmAbs.
   1. تحديد تركيز المادة المرجعية وعينة التحكم والعينة التحليلية من خلال امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر باستخدام معامل الانقراض الشامل (1.39).
      ملاحظه: يمكن أخذ التركيزات الأصلية من ملصقات المنتجات الدوائية. ومع ذلك ، يجب التحقق من ذلك عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية.
2. تخفيفات mAb.
   1. قم بتخفيف جميع العينات بشكل مستقل في ثلاث نسخ ، باستخدام محلول خال من المغنيم والكالسيوم DPBS في أنابيب دقيقة سعة 2 مل ، حتى 2 مجم / مل. تأكد من هذا التركيز عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في ثلاث نسخ ، باستخدام محلول خال من المغنيسيوم والكالسيوم DPBS كفارغ.
   2. اخلطي محاليل البروتين لمدة 5 ثوان باستخدام خلاط دوامة.
   3. قم بتخفيف 100 ميكرولتر من كل محلول 2 مجم / مل مللي أمبير مع 0.9 مل من وسط زراعة الفحص.
   4. امزج لمدة 5 ثوان بخلاط دوامة.
      ملاحظه: يبلغ تركيز هذه المحاليل 200 ميكروغرام / مل. يجب إجراء التخفيفات لكل ثلاث نسخ.
   5. قم بتخفيف 10 ميكرولتر من كل محلول 200 ميكروغرام / مل مللي أمبير مع 0.99 مل من وسط زراعة المقايسة. تخلط لمدة 5 ثوان باستخدام خلاط دوامة. يبلغ تركيز هذه المحاليل 2 ميكروغرام / مل. قم بإجراء تخفيفات تسلسلية لكل ثلاث نسخ قبل استخدامها في مقايسة التحييد.
   6. قم بعمل تخفيفات مضادة ل TNFα mAb في ثلاث صفائح دقيقة مستقلة. قم بعمل نسخة مكررة من كل ثلاث نسخ مستقلة وقم بتوزيعها في صفيحة واحدة ، كما هو موضح في الجدول 1. المادة المرجعية
   7. قم بإجراء تخفيفات mAb لكل مرجع أو عينة أو عنصر تحكم ، كما هو موضح في الجدول 2.
      ملاحظه: التركيزات المضادة ل TNFα mAb الموصوفة في هذا الجدول ليست التركيزات النهائية في مقايسة التحييد.
   8. احتفظ بالأطباق في 25 ± 5 درجة مئوية حتى الاستخدام.

< p class = "jove_title" >4. فحص التحييد باستخدام خلايا WEHI 164

1. امزج عن طريق دوامة جميع معلقات الخلايا (0.5 × 10⁶ خلايا / مل) قبل الاستغناء عنها في أي خطوة من خطوات هذا البروتوكول.
   ملاحظه: في هذا القسم ، قم بتسخين كل محلول إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
2. انقل 50 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من 60 بئرا من الصفائح الدقيقة ، وانتقل من العمود 2 إلى 11 والخط B إلى G.
3. انقل 50 ميكرولتر من التخفيفات المرجعية والعينة والتحكم في mAb إلى ألواح دقيقة. اتبع النمط الموضح في الشكل 1.
4. أضف 50 ميكرولتر من محلول تحريض موت الخلايا المبرمج إلى كل بئر.
5. استخدم أدوات التحكم الخلوية من 50 ميكرولتر من خلايا WEHI 164 ، موزعة في ثلاثة آبار. اجلب كل بئر إلى الحجم النهائي البالغ 150 ميكرولتر باستخدام وسيط ثقافة الفحص.
6. استخدم التحكم في السمية الخلوية لمزيج من 50 ميكرولتر من خلايا WEHI 164 بالإضافة إلى 50 ميكرولتر من محلول تحريض موت الخلايا المبرمج. اجلب كل بئر إلى الحجم النهائي البالغ 150 ميكرولتر باستخدام وسيط ثقافة الفحص.
7. للتحكم في TNFα ، استخدم 50 ميكرولتر من محلول تحريض موت الخلايا المبرمج واجعله يصل إلى 150 ميكرولتر باستخدام وسط ثقافة الفحص.
8. بالنسبة للفراغ ، استخدم 150 ميكرولتر من وسط ثقافة الفحص وحده.
9. املأ الآبار المتبقية ب 150 ميكرولتر من وسط الاستزراع لتجنب تأثيرات تبخر الألواح.
10. كرر الخطوات 4.1.1-4.1.9 مرتين في صفيحتين دقيقتين أخريين.
    ملاحظه: التركيزات النهائية mAb في الصفيحة الدقيقة هي: 0.666 ، 0.333 ، 0.167 ، 0.111 ، 0.083 ، 0.056 ، 0.042 ، 0.028 ، 0.014 ، و 0.004 ميكروغرام / مل.
11. قم بتحميل العينات في ألواح دقيقة ، كما هو موضح في الشكل 1
12. احتضان الألواح الثلاث عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 16 ± 2 ساعة.
13. دع كاشف caspase 3/7 Glo يقف عند 25 ± 5 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
14. أضف 100 ميكرولتر من هذا الكاشف إلى جميع الآبار ، بما في ذلك العينات والضوابط.
15. رج الألواح باستخدام خلاط دوامة صفيحة دقيقة لمدة 3 دقائق عند 25 ± 5 درجة مئوية مباشرة بعد الاستغناء عنها في الآبار.
16. احتضان الألواح لمدة 2.5 ± 0.5 ساعة عند 25 ± 5 درجة مئوية ، محمية من الضوء.
17. أدخل الألواح الدقيقة في مقياس الإضاءة وأكمل القسم التالي.

< p class = "jove_title" >5. تحليل النتائج

1. باستخدام برنامج للكشف عن التلألؤ ، حدد وضع التلألؤ ووظيفة نقطة النهاية.
2. حدد صفيحة ذات قاع شفاف مكون من 96 بئرا وآبارها الداخلية البالغ عددها 80 بئرا ، باستثناء العمودين 1 و 12.
3. حدد وقت تكامل يبلغ 1,250 مللي ثانية و 10 ثوان لخلط الصفيحة الدقيقة قبل القراءة.
4. حدد الآبار التي سيتم وضع المادة المرجعية والمادة التحليلية وعينة التحكم فيها وتحديدها بتركيزاتها المقابلة.
5. اقرأ العينات الموضوعة في الألواح الدقيقة باستخدام مقياس الإلواء.
6. استخدم معادلة المعلمة الرابعة لتحليل النتائج. رسم بياني لمنحنى استجابة الجرعة ، كما هو موضح في الشكل 2.
   ملاحظة: في معادلة المعلمة الرابعة ، C هو التركيز الفعال 50 (EC50). سيتم استخدام هذه القيمة لمقارنة المادة المرجعية والعينة التحليلية وعينة التحكم عن طريق وظيفة المستجيب.
7. لحساب الفاعلية النسبية ، قم بإصلاح المادة المرجعية لحساب 100٪ من فاعلية العينة ، والتحكم وفقا لذلك.
   ملاحظه: هذه القيم موضحة في الشكل 3.

< p class = "jove_content" > الجدول 1: مصفوفات عينات Microplate. يجب إجراء مقايسة تحييد كاملة في ثلاث صفائح دقيقة ضمن الإحداثيات B2 إلى G11. يسمح الاستغناء العشوائي عن العينات المرجعية والتحليلية والضابطة للباحثين بالتحقق من أي تحيز في الفحص. اللوحة 1 اللوحة 2 < td colspan = "2" > اللوحة 3 آبار عينة آبار عينة آبار عينة ب 2: ب 11 المادة المرجعية ب 2: ب 11 عينة التحكم ب 2: ب 11 عينة تحليلية ج2: ج11 ج2: ج11 ج2: ج11 D2: D11 عينة تحليلية D2: D11 المادة المرجعية D2: D11 عينة التحكم E2: E11 E2: E11 E2: E11 F2: F11 عينة التحكم F2: F11 عينة تحليلية F2: F11 المادة المرجعية G2: G11 G2: G11 G2: G11 < p class = "jove_content" >الجدول 2: التخفيفات المضادة ل TNFα mAb. يتم توضيح التخفيفات التسلسلية ل mAbs المضادة ل TNFα في هذا الجدول. التركيزات النهائية الموضحة في هذا الجدول ليست التركيزات الموجودة في الفحص ، حيث تم تخفيف mAbs المضادة ل TNFα بمعامل 3 (تخفيف mAb + وسط الثقافة + تعليق الخلايا). تمثل الخطوط المكتوبة بالخط العريض التخفيفات القادمة من الأسطر 3 و 5 و 7 و 9 و 10. تمثل الخطوط غير الغامقة التخفيف من الأسطر 3 و 4 و 6. تتم هذه التخفيفات التسلسلية قبل إجراء فحص التحييد. يجب توخي الحذر للخلط عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ثلاث مرات قبل توزيع التخفيفات. عمود اللوحة حجم وسط استزراع الفحص (ميكرولتر) حجم المادة المرجعية أو العينة التحليلية أو عينة التحكم (uL) التركيز في لوحة الفحص (نانوغرام / مل) 2 0 230 2000 3 150 حيا 150 من السطر 2 1000 4 75 75 من السطر 3 500 جنيه 5 100 50 من السطر 3 333 6 75 75 من السطر 4 250 حيا 7 75 75 من السطر 5 166 8 75 75 من السطر 6 125 ريال 9 75 75 من السطر 7 83 10 75 75 من السطر 9 41 11 150 حيا 75 من السطر 10 13

النتائج

الشكل 1: التخلص من العينات في لوحات الفحص. B1 إلى G11 هي إحداثيات جيدة في الصفائح الدقيقة وتصف المواضع التي توضع فيها تخفيفات العينة. الإحداثيات المفقودة هي آبار مملوءة بأدوات التحكم ووسط ثقافة الفحص (A1-A12 و H1-H12). يساعد هذا التوزيع العشوائي للعينات (التخفيفات الأمامية والعكسية في الصفائح الدقيقة) على القضاء على التحيز في النتائج بسبب تبخر الوسط أو المتغيرات الأخرى. من الأفضل أن يتم عمل كل صفيحة ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ويهي 164 ATCC [رل-1751] خلايا الساركوما الليفية من Mus musculus RPMI-1640 متوسط ATCC 30-2001 يحفظ متوسط في درجة حرارة 2 درجة مئوية إلى 8 درجات مئوية RPMI 1640 متوسط ، بدون فينول أحمر جيبكو 11835-030 يحفظ متوسط في درجة حرارة 2 درجة مئوية إلى 8 درجات مئوية التربسين EDTA (0.25٪) ، أحمر الفينول جيبكو هاتف: 25200-056 يحفظ متوسطا عند -10 درجة مئوية إلى -20 درجة مئوية DPBS، خال من الكالسيوم والمغنيسيوم جيبكو 14190-136 يحفظ متوسط في درجة حرارة 2 درجة مئوية إلى 8 درجات مئوية بروتين TNF-alpha البشري المؤتلف أنظمة البحث والتطوير 210-TA-020 يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية إلى -70 درجة مئوية مصل الأبقار الجنينية (الولايات المتحدة) ، IgG منخفض للغاية HyClone SH3089803 يحفظ في درجة حرارة -10 درجة مئوية إلى -20 درجة مئوية مصل الأبقار الجنينية (الولايات المتحدة) ، مميز HyClone SH3007103 يحفظ في درجة حرارة -10 درجة مئوية إلى -20 درجة مئوية مجموعة فحص Caspase-Glo 3/7 بروميجا جي 8093 قم بتخزين الركيزة Caspase-Glo. 3/7 و Caspase-Glo. 3/7 Buffer عند -20 درجة مئوية محمية منLight EDTA ، ملح ثنائي الصوديوم ، ثنائي الهيدرات ، الكريستال ، كاشف ACS جي تي بيكر 8993-01 -- عينة mAb Adalimumab بروبيوميد غير أ التركيزات النهائية في الصفيحة الدقيقة هي: 0.666 ، 0.333 ، 0.167 ، 0.111 ، 0.083 ، 0.056 ، 0.042 ، 0.028 ، 0.014 و 0.004 ميكروغرام / مل المرجع والتحكم mAb Adalimumab آبفي غير أ التركيزات النهائية في الصفيحة الدقيقة هي: 0.666 ، 0.333 ، 0.167 ، 0.111 ، 0.083 ، 0.056 ، 0.042 ، 0.028 ، 0.014 و 0.004 ميكروغرام / مل قارئ الألواح الدقيقة الأجهزة الجزيئية 89429-536 SpectraMax M3 متعدد الأوضاع برنامج قارئ اللوحة الدقيقة الأجهزة الجزيئية -- سوفت ماكس برو 6.3 جيجابايت حاضنه ريفكو 30482 ريفكو RNW3000TABB الهواء القسري CO2 غطاء التدفق الصفحي شركة بيكر 200256 بيكر SG603A-HE | كفاءة عالية ، من الفئة الثانية من النوع A2