اختبار الخلايا المتغصنة النبضية باللقاح للحث على تكاثر الخلايا الليمفاوية

الملخص

المصدر: Liaqat، F.، et al.، تحديد مناعة اللقاح باستخدام الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الأبقارية أحادية. J. Vis. Exp. (195) ، (2023).

يوضح هذا الفيديو خلية شجيرية مشتقة من الخلية الأحادية ، ومقايسة قائمة على وزارة التدقيق لقياس مناعة اللقاحات المتاحة تجاريا. تبحث فحوصات وزارة الدفاع في استجابات الخلايا المتغصنة للمستضدات أو مسببات الأمراض أو العلاجات ويمكن أن توفر رؤى حول الاستجابات المناعية وتطوير اللقاحات وأبحاث العلاج المناعي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إنتاج MoDCs الساذجة

< p class = "jove_content" >ملاحظة: تم الحصول على عينات دم كاملة من ربلة ساق واحدة خالية من مسببات الأمراض عن طريق ثقب الوريد الوداجي باستخدام فراغات هيبارين (تم استخدام ثمانية أنابيب دم سعة 9 مل لهذه الدراسة). انقل الدم في صندوق ثلج. قم بتخزين العينات في درجة حرارة 2-4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا ، أو قم بمعالجتها على الفور. حافظ على دوران الدم لتجنب تخثر الدم. تعقيم المكانس الكهربائية بنسبة 70٪ من الإيثانول. تم إجراء جميع التجارب التالية بعينة بيولوجية واحدة وست تكرارات تقنية.

1. الطرد المركزي المتدرج للكثافة لعزل PBMCs من الدم الهيباريني
   1. امزج الدم جيدا عن طريق قلبه 10x.
   2. باستخدام ماصة سعة 10 مل ، انقل 20 مل من الدم الهيباريني إلى أنبوب معقم سعة 50 مل ، وقم بتخفيفه ب 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
   3. ماصة 15 مل من وسط عزل الخلايا الليمفاوية إلى أنبوب معقم سعة 50 مل.
      ملاحظه: اسمح لوسط عزل الخلايا الليمفاوية بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل سحب العينات.
   4. قم بإمالة الأنبوب سعة 50 مل الذي يحتوي على وسط عزل الخلايا الليمفاوية إلى موضع 45 درجة. وجه طرف ماصة سعة 25 مل بشكل عمودي ، وقم بطبقة 30 مل من PBS الدم بعناية فوق وسط عزل الخلايا الليمفاوية ، دون خلط الاثنين. ببطء شديد ، أعد الأنبوب سعة 50 مل إلى الوضع الرأسي.
   5. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 35 دقيقة عند 20 درجة مئوية مع أقصى تسارع وبدون فرملة (إيقاف تشغيل وظيفة التباطؤ).
   6. استخدم ماصة باستور لتجميع طبقة PBMC (الطبقة البيضاء الرقيقة مباشرة بعد الطبقة الأولى من البلازما) ونقلها إلى أنبوب جديد سعة 50 مل.
      ملاحظه: يفصل الطرد المركزي المتدرج الكثافة الدم الكامل إلى طبقات مختلفة. نتيجة لذلك ، تستقر كريات الدم الحمراء في الأسفل على شكل حبيبات ، وتستقر الخلايا أحادية النواة (PBMCs) في طبقة الواجهة ، وتشكل البلازما الطبقة العليا. تم العثور على الخلايا المحببة بين الحبيبات وطبقة PBMC.
   7. اغسل PBMCs المحصودة 2x عن طريق إضافة PBS حتى حجم 40 مل وخلطه جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. ثم ، جهاز الطرد المركزي عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 7 دقائق مع أقصى تسارع وأقصى تباطؤ.
   8. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، وأعد تعليق الحبيبات في 15 مل من 1x عازلة الأمونيوم وكلوريد البوتاسيوم (ACK) ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة
      ملاحظه: لا تحتضن لأكثر من 15 دقيقة. يتم استخدام المخزن المؤقت ACK المتاح تجاريا لضمان تحلل خلايا الدم الحمراء المتبقية (RBCs) الموجودة في جزء PBMC.
   9. أضف PBS حتى حجم 40 مل ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 500 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 7 دقائق مع أقصى تسارع وتباطؤ.
   10. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، وكرر الخطوة 1.1.9.
   11. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسط الثقافة الكامل (في درجة حرارة الغرفة).
       ملاحظه: يتكون وسط الاستزراع الكامل من وسط زراعة الخلايا RPMI 1640 مكمل بمصل بقري جنيني 10٪ (FBS) و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
2. الفصل المغناطيسي لخلايا CD14 ^+/- عن مجموعة PBMC باستخدام حبات مغناطيسية مترافقة CD14
   1. عد الخلايا باستخدام عداد خلية نظيف لمقياس الدم باستخدام 10 ميكرولتر من معلق الخلية الممزوج ب 10 ميكرولتر من محلول التريبان الأزرق (0.4٪><). ملاحظة: صبغة التريبان الزرقاء مادة كيميائية سامة ومسرطنة محتملة. يجب التعامل معها أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية (PPE) لتجنب ملامسة النفايات ، ويجب التخلص من النفايات في حاوية نفايات سامة متخصصة محكمة الإغلاق. ستظهر الخلايا الميتة باللون الأزرق ، بينما ستظهر الخلايا الحية واضحة تحت المجهر.
   2. جهاز طرد مركزي لمدة 7 دقائق عند 500 × جم.
   3. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ، وأعد تعليق الحبيبات في مخزن فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) باستخدام حجم 40 ميكرولتر لكل 1 × 10⁷ خلايا. تخلط جيدا باستخدام ماصة.
      ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت FACS من 2٪ FBS و 2 ملي مولار من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) المذاب في PBS.
   4. أضف 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت الميكروبيد CD14 لكل 1 × 10⁷ خلية، واخلطه جيدا باستخدام ماصة.
   5. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 4-8 درجات مئوية للاختيار الإيجابي للخلايا الوحيدة البقرية CD14 ⁺. دوامة كل 15 دقيقة خلال فترة الحضانة.
   6. خطوة اختيارية (لتحليل قياس التدفق الخلوي): أضف 10 ميكرولتر من الجسم المضاد الملطخ CD14-FITC (الفلورسين إيزوثيوسيانات) مع الحضانة اللاحقة لمدة 15 دقيقة عند 4-8 درجات مئوية.
   7. أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 500 × جم.
   8. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لكل 1 × 10⁸ خلايا.
   9. أدخل عمود فصل الخلايا المغناطيسية المناعية في الفاصل (حامل العمود المغناطيسي) ، وضع أنبوب تجميع سعة 15 مل أسفل مخرج العمود لتجميع التدفق.
   10. اغسل العمود ب 1 مل من المخزن المؤقت FACS منزوع الغاز. بعد الشطف ، استبدل الأنبوب المستخدم سعة 15 مل بآخر جديد.
   11. اسمح لتعليق الخلية (من الخطوة 1.2.8) بالمرور عبر العمود عن طريق سحب ماصات 1 × 10⁸ خلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت في المرة الواحدة.
       ملاحظه: انتبه إلى عدم توليد فقاعات هواء أثناء خلط الخلايا قبل السماح لها بالمرور عبر العمود.
   12. اشطف العمود 3x ب 3 مل من المخزن المؤقت FACS منزوع الغاز في كل مرة.
   13. اجمع التدفق ، وقم بتسمية هذا الجزء الأول المملوء بأنه جزء الخلية CD14 ⁻ (PBMCs ناقص الخلايا الوحيدة CD14 ⁺) ؛ وهذا ما يسمى أيضا جزء الخلايا الليمفاوية الساذجة.
       ملاحظه: يتم الحفاظ على خلايا CD14 في وسط ثقافة كامل حتى يتم إنتاج MoDCs النبضية بالمستضد.
   14. قم بإزالة العمود من الفاصل.
   15. ضع أنبوبا معقما جديدا سعة 15 مل أسفل العمود لجمع النفايات السائلة.
   16. ماصة 5 مل من المخزن المؤقت FACS في العمود ، وادفعها على الفور باستخدام مكبس.
   17. اجمع التدفق ، وقم بتسمية هذا الكسر الثاني المغطى بأنه جزء الخلية CD14 ⁺ ؛ وهذا ما يسمى أيضا جزء الخلية الوحيدة الساذج.
   18. أضف وسط مزرعة كامل إلى الخلايا الوحيدة CD14 ⁺ المحصودة للوصول إلى 1 × 10⁶ خلايا / مل
       ملاحظه: عد الخلايا الحية في جزء الخلية CD14 ⁺ الملطوع لتقدير حجم وسط الثقافة الكامل المطلوب للوصول إلى عدد الخلايا المطلوب.
   19. خذ طبقا معقما من 24 بئرا ، وأضف 1 مل من معلق الخلية (1 × 10⁶ خلايا / مل) إلى كل بئر.
3. تمايز الخلايا الوحيدة الساذجة CD14 ⁺ إلى MoDCs ساذجة عن طريق إضافة 3٪ مع / v كوكتيل السيتوكين (GM-CSF + IL-4) بإجمالي 5 أيام من الحضانة
   1. استكمل كل بئر يحتوي على الخلايا الوحيدة CD14 ⁺ ب 40 ميكرولتر (3٪ وزن / حجم) من كوكتيل السيتوكين الموجود في المجموعة.
   2. احتضان اللوحة في حاضنة رطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ وعند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
   3. في اليوم 2، انقل نصف محتوى كل بئر (500 ميكرولتر) باستخدام ماصة إلى أنابيب فردية سعة 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 7 دقائق.
   4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل الطازج.
   5. انقل 500 ميكرولتر من معلق الخلية هذا من الخطوة 1.3.4 مرة أخرى إلى كل بئر معين بحيث يكون الحجم النهائي 1 مل.
   6. إثراء كل بئر ب 20 ميكرولتر من كوكتيل السيتوكين.
   7. احتضان المزرعة لمدة 72 ساعة في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ وعند 37 درجة مئوية.
   8. بعد الحضانة في اليوم 5 ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة.
      ملاحظة: سيحتوي كل بئر على 1 مل من معلق الخلية من MoDCs الساذجة. سيكون عدد MoDCs نسبة مئوية (~ 20٪) من الخلايا الوحيدة الأصلية المطلية (1 × 10⁶ / مل).

< p class = "jove_title" >2. توليد MoDCs النبضية للمستضد

ملاحظة: يمكن للقاح المتاح تجاريا والمعتمد سريريا ضد فيروس داء (RV) أن يحفز تمايز MoDCs الساذجة إلى MoDCs الناضجة التي تقدم المستضد. استخدم 0.1٪ (~ 1 ميكرولتر) من جرعة تطعيم RV واحدة لتوليد MoDCs النبضية بالمستضد. علاوة على ذلك ، يفضل إنتاج MoDCs ذات نبض RV في نفس لوحة الثقافة المستخدمة لتوليد MoDCs ساذجة لأن نقل MoDCs الساذجة إلى صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا سيؤثر سلبا عليها.

1. أضف 1 ميكرولتر / مل من تعليق RV إلى 1 مل من ثقافة MoDC الساذجة في اللوحة المكونة من 24 بئرا ، واحتضانها لمدة 48 ساعة عند 5٪ CO₂ و 37 درجة مئوية><. ملاحظة: يتم استخدام MoDCs الساذجة المزروعة بدون تحفيز RV كعنصر تحكم في الخلفية (وكتحفيز غير محدد للزراعة المشتركة مع الخلايا الليمفاوية في الخطوات التالية).
2. بعد الحضانة ، في اليوم 7 ، احتفظ بالصفيحة المكونة من 24 بئرا التي تحتوي على MoDCs النبضية بالمستضد على الجليد لمدة 10 دقائق.
3. أضف 1 مل من PBS المثلج لكل بئر. امزج كل بئر جيدا عن طريق سحب العينات ، وانقل المعلق إلى أنبوب سعة 15 مل.
4. اغسل الآبار ب 2 مل من PBS المثلج لجمع الخلايا المتبقية المتبقية داخل كل بئر.
5. انقل المحتويات إلى الأنابيب الخاصة بها ، وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 7 دقائق.
6. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية (MoDCs النبضية بالمستضد) في وسط ثقافة كامل ، واضبط الحجم على تركيز خلية نهائي يبلغ 1 × 10⁵ خلايا / مل.
   ملاحظه: عد الخلايا الحية لتقدير حجم الوسيط المطلوب للوصول إلى عدد الخلايا المطلوب. استخدم MoDCs النبضية RV من اليوم 7 لنظام الزراعة المشتركة للخلايا الليمفاوية MoDC.

فئة

3. الزراعة المشتركة للخلايا الليمفاوية MoDC

-

ملاحظة: يحدد نظام الزراعة المشتركة للخلايا الليمفاوية MoDC-Modc في المختبر قدرة MoDCs على تحضير الخلايا الليمفاوية الخاصة بالمستضد. تشمل مجموعات العلاج المختلفة للخلايا بعد 16 يوما من الزراعة المشتركة محددة وغير محددة وتحكم. يتم تعريف المجموعة المحددة على أنها الخلايا الليمفاوية المزروعة بشكل مشترك مع MoDCs النبضية RV. يتم تعريف المجموعة غير المحددة على أنها الخلايا الليمفاوية المزروعة بشكل مشترك مع MoDCs غير النبضية بالمستضد. ويتم تعريف المجموعة الضابطة على أنها الخلايا الليمفاوية المستزرعة بدون MoDCs.

1. أضف وسط مزرعة كامل إلى جزء الخلايا الليمفاوية الساذجة المملوءة (خلايا CD14⁻) للوصول إلى تركيز خلية يبلغ 2 × 10⁶ خلايا / مل
   ملاحظة: عد الخلايا الحية في ثقافة الخلايا CD14 التي تم الحفاظ عليها في وسط مزرعة كامل في صفيحة 24 بئرا منذ جمعها لتقدير حجم الوسط المطلوب للوصول إلى عدد الخلايا المطلوب.
2. في اليوم 7 ، خذ طبقا معقما من 24 بئرا ، وقم بزرع الآبار ب 1 مل من تعليق الخلايا الليمفاوية الساذجة (2 × 10⁶ خلايا / مل) بالإضافة إلى 1 مل من تعليق MoDC النبضي بالمستضد أو غير النبضي بالمستضد (1 × 10⁵ خلية / مل).
   ملاحظه: سيكون الحجم الإجمالي في كل بئر 2 مل بنسبة 1:20 MoDCs إلى الخلايا الليمفاوية لكل بئر.
3. احتضان اللوحة لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
4. إثراء الثقافة وإعادة التحفيز باستخدام Modcs النبضية للمستضد
   1. بعد حضانة الثقافة المشتركة للخلايا الليمفاوية MoDC-النبضية النبضية بالمستضد ، في اليوم 9 ، استكمل كل بئر ب 20 نانوغرام / مل IL-2 المؤتلف ، واستمر في الحضانة لمدة 120 ساعة أخرى (حضانة 5 أيام).
   2. في اليوم 14 ، انقل 1 مل من الزراعة المشتركة إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مل ، وجهاز طرد مركزي بوزن 500 × جم لمدة 7 دقائق.
   3. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 1 مل من MoDCs النبضية أو غير النبضية (1 × 10⁵ خلية / مل). امزج برفق عن طريق سحب العينة ، وانقل معلقات الخلية مرة أخرى إلى الآبار المخصصة لها.
      ملاحظه: في هذه الخطوة ، الحجم الكلي في كل بئر هو 2 مل.
   4. استمر في الحضانة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ و 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بعد الحضانة في اليوم 16 ، تكون الزراعة المشتركة جاهزة للتحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي و qPCR و ELISA.
      ملاحظه: لكل 2 مل في كل بئر من الزراعة المشتركة للخلايا الليمفاوية MoDC، يتم تلطيخ 1 مل من الخلايا المعلقة لقياس التدفق الخلوي، ويستخدم 1 مل لاستخراج الحمض النووي الريبي، وتستخدم المواد الطافية من كليهما ل ELISA.

< p class = "jove_title" >4. تحليل التدفق الخلوي

ملاحظة: قم بتلطيخ الخلايا بعلامات / مللي أمبير مناسبة قبل تشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي. ارجع إلى جدول المواد للحصول على تفاصيل حول الكواشف (تلطيخ mAb وعناصر التحكم في النمط المتماثل) ، والمجموعة ، والأدوات ، والبرامج المستخدمة لتحليل قياس التدفق الخلوي.

1. بروتوكول تلطيخ مقياس التدفق الخلوي
   ملاحظه: قم بإجراء تلطيخ سطح الخلية ل PBMCs والخلايا الليمفاوية الساذجة والخلايا الوحيدة باستخدام مضاد CD14 mAb (الخطوة 1.2.6). بالنسبة لتلوين سطح الخلية ل MoDCs الساذجة ، استخدم mAb المضاد ل CD86 ، ومضاد ل CD40 ، ومضاد ل معقد التوافق النسيجي الكبير II. بالنسبة لتلوين سطح الخلية للخلايا من اليوم 16 للثقافات المشتركة ، استخدم مضاد CD4 ، ومضاد CD8 ، ومضاد ل CD25 mAbs. للتلوين داخل الخلايا ، استخدم مضاد Ki-67 mAb. علاوة على ذلك ، قم بتلطيخ الخلايا إما بتحكم في النمط المتملي سالب mAb أو بدون mAb (FMO: الفلورسنت ناقص واحد). يتمثل الاختلاف الرئيسي عند تلطيخ العلامات السطحية وداخل الخلايا في أنه بالنسبة لعلامات سطح الخلية ، يجب تلطيخ الخلايا بسطح معين mAb قبل تلطيخ الحي / الميت (L / D) أو أي عمليات أخرى. ومع ذلك ، يتم إجراء التلوين داخل الخلايا بعد تلطيخ L / D ويتطلب تثبيتا بالإضافة إلى خطوة نفاذية للسماح بالاختراق داخل الخلايا.
   1. انقل 1 مل من تعليق الخلية إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مل باستخدام ماصة ، وجهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 500 × جم
      ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، عند معالجة الخلايا من الثقافة المشتركة للخلايا الليمفاوية MoDC، احفظ المادة الطافية لتحليل ELISA.
   2. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من PBS ، وانقلها إلى أنبوب 15 مل. اجمع الخلايا المتبقية باستخدام 1 مل من PBS ، واجمعها مع الحبيبات المعلقة.
   3. أضف 10 مل من PBS إلى الأنبوب سعة 15 مل الذي يحتوي على الخلايا ، واخلطه عن طريق سحب العينات ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 850 × جم.
   4. تخلص من المادة الطافية ، وكرر الخطوة 4.1.3.
   5. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية بعناية مع التعليق المتبقي (حوالي 180 ميكرولتر) المتبقي بعد صب المادة الطافية.
   6. انقل تعليق الخلية إلى صفيحة ذات 96 بئرا على شكل حرف V ، وأغلق الآبار لتجنب الانسكاب.
   7. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 1,400 × جم لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بتحريك اللوحة فوق حاوية النفايات لتفريغ الآبار من السائل ، واضغط على اللوحة على ورق ماص لضمان إزالة السوائل الزائدة.
   8. أضف 25 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لتلوين السطح لكل بئر ، واخلطه برفق باستخدام ماصة ، متبوعا بالحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة < br / > ملاحظه: لتحضير المزيج الرئيسي لتلوين السطح لبئر واحد ، أضف 2.5 ميكرولتر من ملي أمبير السطحي إلى 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
   9. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لكل بئر ، وجهاز الطرد المركزي عند 1,400 × جم لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، أفرغ الآبار من السائل عن طريق الصب ، واضغط على اللوحة على ورق ماص لإزالة السوائل الزائدة.
   10. أضف 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ L / D لكل بئر. تخلط جيدا باستخدام ماصة ، متبوعة بالحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام.
       ملاحظه: لبئر واحد ، قم بإذابة 0.25 ميكرولتر من صبغة L / D في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. تساعد صبغة L / D على التمييز بين الخلايا الحية والميتة.
   11. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. قم بتغطية الآبار بالغطاء ، وقم بالطرد المركزي للوحة لمدة 1,400 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، واضغط على اللوحة على ورق ماص.
   12. كرر الخطوة 4.1.11.
   13. أضف 50 ميكرولتر من محلول التثبيت لكل بئر (مرفق مع المجموعة) ، واخلطه بماصة قبل احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 10 دقائق.
   14. أضف 150 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت للغسيل (PW) المرفق مع المجموعة ، وقم بتغطية الآبار بالغطاء.
       ملاحظه: لتحضير 10 مل من المخزن المؤقت 1x PW ، قم بتخفيف 1 مل من المخزن المؤقت 10x perm في 10 مل من dH₂O.
   15. قم بالطرد المركزي للوحة عند 1,400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   16. أضف 200 ميكرولتر من 1x PW ، متبوعا بالطرد المركزي عند 1,400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، واضغط على اللوحة على ورق ماص.
   17. للتلوين داخل الخلايا ، أضف 25 ميكرولتر من مزيج التلوين الرئيسي داخل الخلايا (Ki-67 mAb المضاد للإنسان) لكل بئر. تخلط جيدا ، وتحتضن الطبق لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية أو على الثلج في الظلام.
       ملاحظه: لتحضير مزيج التلوين الرئيسي داخل الخلايا لبئر واحد ، أضف 1 ميكرولتر من Ki-67 mAb إلى 24 ميكرولتر من 1x PW. يتم استخدام علامة التلوين داخل الخلايا فقط عند معالجة الخلايا من اليوم 16 للزراعة المشتركة. لا يتم التلوين داخل الخلايا أثناء معالجة PBMCs والخلايا الليمفاوية الساذجة والخلايا الوحيدة و MoDCs الساذجة.
   18. بعد الحضانة ، أضف 200 ميكرولتر من 1x PW إلى كل بئر. تخلط مع ماصة وجهاز طرد مركزي لمدة 1,400 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، واضغط على اللوحة على ورق ماص.
   19. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، متبوعا بالطرد المركزي عند 1,400 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب ، واضغط على اللوحة على ورق ماص.
   20. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، وانقل محتويات كل بئر لفصل أنابيب مقياس التدفق الخلوي المعقمة. استخدم 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لكل بئر لجمع الخلايا المتبقية. الخلايا جاهزة الآن لتحليل قياس التدفق الخلوي.
2. تشغيل العينة على مقياس التدفق الخلوي
   ملاحظه: تم تشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي (باستخدام ليزر 488 نانومتر و 638 نانومتر و 405 نانومتر) وفقا لدليل الشركة المصنعة. راجع الدليل للحصول على التفاصيل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتخصيصها.
   1. قم بإجراء إجراءات التنظيف الروتينية قبل وبعد قراءة العينات.
      ملاحظه: لا تتخطى موضعا أثناء تحميل الأنابيب في الجهاز.
      1. بالنسبة لدورة التنظيف ، استخدم ما مجموعه أربعة أنابيب ، مع احتواء الأنبوب الأول على كاشف تنظيف التدفق والأنابيب الثلاثة المتبقية التي تحتوي على dH₂O ؛ سيكون لكل أنبوب 3 مل. أثناء تشغيل التنظيف ، احصل على بيانات بمعدل تدفق متوسط لمدة دقيقة واحدة تقريبا عن طريق التقاط 100,000 حدث لكل أنبوب أقل من 330 فولت للتشتت الأمامي (FSC) مقابل 265 فولت للتشتت الجانبي (SSC).
         ملاحظه: لا ينبغي الإبلاغ عن أي حطام أو أحداث خلوية أثناء التنظيف. إذا حدث هذا ، فقم بإجراء خطوة التنظيف مرة أخرى. لتشغيل العينات ، تأكد من أن جميع العينات في حالة تعليق متجانس قبل الحصول على البيانات لأن هذا يضمن قراءة دقيقة.
   2. لتوصيل مقياس الخلوي وتشغيله ، انقر فوق زر التطبيق الموجود في الزاوية اليسرى من شريط العنوان. من القائمة المنسدلة للتطبيق ، حدد الخيار قياس الخلايا ، وانقر فوق الخيار تشغيل التشغيل.
      ملاحظه: من القائمة المنسدلة للتطبيق ، يتيح الخيار فتح للمستخدمين تصفح المقايسات المبرمجة مسبقا ، بينما يسمح خيار البروتوكول الجديد للمستخدمين بإنشاء بروتوكولات جديدة.
   3. قم بتحميل عينة التحكم السلبية في البداية في حامل الأنابيب المتعددة. حدد بروتوكول جديد، وراقب قائمة العمل على الجانب الأيسر من مساحة العمل/الشاشة.
   4. في قائمة العمل، حدد موضع العينة في حامل الأنابيب المتعددة، وأعط اسما للعينة والبروتوكول لتحديد الهوية.
   5. من لوحة الأجهزة الموجودة على الجانب الأيسر من مساحة العمل ، اضبط وحدد معلمات متعددة مثل أجهزة الكشف (FSC و SSC و 10 نطاقات مضانة) ، والفولتية (V) ، ومكاسب المضاعفات الضوئية ، وعرض ارتفاع المنطقة (AHW) للإشارة.
      ملاحظه: تم اختيار الإعدادات التالية للكاشفات بناء على التجربة والجهاز المستخدم: FSC-AHW: AHW ، V: 270 ، G: 5 ؛ SSC-AHW: أ ، الخامس: 350 ، ز: 10 ؛ FL1 (CD8 / FITC Dextran) -AHW: A ، V: 400 ، G: 1 ؛ FL2 (CD25 / PE) -AHW: A ، V: 500 ، G: 1 ؛ FL6 (CD4 / Alexa Fluor 647) -AHW: A ، V: 700 ، G: 1 ؛ FL7 (Ki-67 / Alexa Fluor 700) -AHW: A ، V: 625 ، G: 1 ؛ FL9 (L / D) -AHW: A ، V: 425 ، G: 1.
   6. من لوحة التحكم في الحصول على الأداة الموجودة أسفل شريط العنوان، اضبط خيارات معدل التدفق (متوسط) والوقت (5 دقائق) والأحداث (انظر الخطوة 5.2.8) المطلوب اكتشافها. انقر فوق الخيار اكتساب فردي للسماح للأداة برسم/تشغيل العينة وإظهار المعاينة في الوقت الفعلي للأحداث المكتشفة.
   7. من المعاينة في الوقت الفعلي ، اضبط عتبة التألق (الجهد والكسب) وحجم الخلية لرسم بوابات في النهاية حول مجموعة الخلايا المطلوبة مع استبعاد أي حطام خلوي.
      ملاحظه: يساعد FSC على تمييز الخلايا على أساس الحجم ، مما يسمح للمستخدمين بالتمييز بين خلايا الجهاز المناعي ، مثل الخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية. الخلايا الوحيدة أكبر وتظهر كثافة FSC أعلى مقارنة بالخلايا الليمفاوية.
   8. الحصول على ما يقرب من 5,000 Modcs حية و 50,000 خلية ليمفاوية حية و 50,000 حدث وحيد حي.
   9. بمجرد ضبط جميع المعلمات بالإشارة إلى عينة التحكم السلبية ، انقر فوق إيقاف ، واحفظ البروتوكول.
   10. الآن قم بتحميل جميع العينات على اللودر متعدد الأنابيب. حدد كل عينة في قائمة العمل، وقم بتطبيق المعلمات المعدلة بالرجوع إلى عنصر التحكم السلبي على جميع العينات داخل التجربة. انقر فوق الخيار الحصول للسماح بتشغيل جميع العينات في التجربة على التوالي.
   11. بمجرد الحصول على البيانات من جميع العينات ، احفظها وحولها إلى بيانات قابلة للقراءة باستخدام برنامج تحليل البيانات المناسب الذي يسمح بإنشاء الرسوم البيانية المتسلسلة ثنائية المعلمة وأحادية المعلمة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ACK Lysing Buffer جيبكو ، ثيرمو فيشر A1049201 مخزن احتياطي لكلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم لتحلل كرات الدم الحمراء المتبقية في جزء PBMC المحصود طقم نمو الخلايا التغصنية البقرية بيو راد ، المملكة المتحدة PBP015KZZ كوكتيل السيتوكين يتكون من الأبقار المؤتلفة IL-4 و GMCSF طقم IFN-γ ELISA البقري بيو راد MCA5638KZZ استخدام المجموعة لقياس تعبير IFN-γ في الثقافة الطافية نوبيفاك داء MSD صحة ، المملكة المتحدة 1 ميكرولتر / مل من اللقاح المعطل المزروع بالخلايا الذي يحتوي على> 2 وحدة دولية / مل سلالة فيروس داء الأختام البصرية Bi0-Rad TCS0803 0.2 مل أنبوب PCR مسطح 8 أغطية شرائط ، بصري ، فائق الوضوح ، متوافق مع جهاز qPCR محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) جيبكو ، ثيرمو فيشر 10010023 درجة الحموضة 7.4 ، تركيز 1x أنبوب FlowTubes / FACS (الفرز أحادي الخلية المنشط الفلوري) فالكون كورنينج 352235 5 مل ، أنبوب اختبار البوليسترين المعقم ، القاع المستدير مع غطاء مصفاة الخلية ، يستخدم في تحليل قياس التدفق الخلوي حبات CD14 البشرية Miltenyi Bioteck ، ألمانيا 130-050-201 2 مل من الميكروبيدات مترافقة مع النمط الإسمالي للجسم المضاد CD14 أحادي النسيلة المضاد للإنسان IgG2a ، ويستخدم لاختيار الخلايا الوحيدة البقرية من PBMCs الجسم المضاد للإنسان المنقى Ki-67 Biolegend ، الولايات المتحدة الأمريكية 350501 الجسم المضاد أحادي النسيلة ، متقاطع مع البقرة ، استنساخ ki-67 RPMI 1640 متوسط سيجما ألدريتش R8758 وسائط زراعة الخلايا مع L-glutamine وبيكربونات الصوديوم لوحة اختبار زراعة الأنسجة 24 TPP, سويسرا 92024 24 صفيحة بئر ، معقمة بالإشعاع ، معالجة معززة للنمو ، حجم 3.18 مل