اختبار اضطراب الخلايا الدموية لتقييم إعادة التصاق الخلايا الدموية بالجيوب المكونة للدم

الملخص

المصدر: Petraki، S. et al.، فحص مجموعات خلايا الدم في ذبابة الفاكهة السوداء يرقات.J. Vis. Exp.(2015)

يوضح هذا الفيديو مقايسة اضطراب الخلايا الدموية ، ويقيم إعادة التصاق الخلايا الدموية في جيوب يرقات ذبابة الفاكهة المكونة للدم. يطلق الاضطراب الميكانيكي خلايا الدم المقيمة ، مما يزيد من عدد الخلايا الدموية المنتشرة. بعد الشفاء ، يتم تأكيد إعادة الالتصاق بالخلايا الدموية المقيمة ، مما يوضح قابلية الانعكاس.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. فحص نزيف الخلايا الدموية / كشط

1. تحضير الشرائح:
   1. الخيار 1 للمجاهر التي لا تحتوي على وظيفة مسح البلاط: لكل يرقة المراد تحليلها ، قم بإعداد شريحة زجاجية واحدة مع حوالي 5 آبار قلم عنق الرحم من مربعات 2 مم لكل منها ، بما يتوافق مع منطقة المشاهدة الميدانية للمجهر ؛ أضف ما يقرب من 5 - 10 ميكرولتر من وسائط S2 لكل منها (الشكل 1 أ). احتفظ بالشرائح في غرفة رطبة لمنع جفاف الآبار.
   2. الخيار 2 للمجاهر المزودة بوظيفة مسح البلاط: لكل يرقة يتم تحليلها ، قم بإعداد شريحة زجاجية واحدة مع 3 إلى 4 آبار قلم عنق الرحم من ~ 3 - 4 مم مربعات لكل منها ؛ أضف ما يقرب من 15 - 20 ميكرولتر من وسائط S2 إلى كل بئر (الشكل 1 ب). احتفظ بالشرائح في غرفة رطبة لمنع جفاف الآبار.
      ملاحظه: العدد الموصى به أعلاه من الآبار كاف لمجاميع تصل إلى 3,000 خلية دموية لكل يرقة (يرقات الطور الثاني المتأخرة ، ~ 2.5 - 3 مم ، والجينات المعدلة وراثيا تسمية غالبية خلايا الدم اليرقاتية). عند تقييم أعداد خلايا الدم الأكبر ، قد تكون هناك حاجة إلى المزيد من الآبار لتجنب الاكتظاظ.
2. مجموعة اليرقات:
   1. رش الماء في قارورة ذبابة تحتوي على يرقات وشطف اليرقات في طبق بتري ، أو اغرف بعض الأطعمة التي تحتوي على اليرقات في طبق بتري وخففها بالماء باستخدام زجاجة بخ
   .
   2. قطف اليرقات برفق من طبق بتري باستخدام فرشاة الرسم وضعها في الماء في طبق تجويف أو على شريحة على كتلة باردة. < / > ملاحظه: يمكن الاحتفاظ باليرقات لفترة محدودة في الماء أو على كتلة باردة ؛ استخدم العينات في غضون 45 دقيقة أو أقل لتجنب موت اليرقات أو التأثيرات غير المرغوب فيها على خلايا الدم.
3. تشريح:
   1. حدد اليرقات تحت المجهر الفلوري على كتلة معدنية باردة. قم بقياس الأحجام ويرقات الصورة إذا رغبت في ذلك.
   2. عزل الخلايا الدموية المنتشرة ("النزيف"):
      1. بمجرد اختيار اليرقات ، ضع يرقة واحدة في أول بئر قلم عنق الرحم (الشكل 1 ج ، 2 أ).
      2. استخدم 2 إبر نظيفة أو مقص تشريح وملقط لعمل شق في كل من الأطراف الخلفية والأمامية لليرقة. لتجنب إزعاج الخلايا الدموية المقيمة ، من الأفضل عمل هذه الشقوق على الجانب البطني من اليرقة. للحصول على نتائج متسقة ، قم بعمل شقوق في نفس المواقع لكل يرقة بالنسبة لليرقات 1st instare ، يكفي شق واحد (في الجزء الأمامي البطني).
      3. اسمح لليرقة بالنزيف لبضع ثوان دون أي ضغط أو إثارة جسدية (الشكل 2 أ).
         ملاحظه: إذا كنت تعمل على يرقات متعددة ، فمن الأفضل عمل هذه الشقوق لكل منها قبل الانتقال إلى الخطوة التالية لتجنب إبقاء اليرقات على الجليد لفترة طويلة مما قد يؤثر على سلامة العينات.
      4. ارفع اليرقة برفق بالإبر أو الملقط واغمسها في البئر الثاني لشطف أي خلايا دموية منتشرة متبقية. بعد ذلك ، اتبع إطلاق الخلايا الدموية المقيمة.
   3. عزل الخلايا الدموية المقيمة ("Scrape"):
      1. انقل اليرقة برفق إلى البئر التالي (الشكل 2 ج).
      2. حدد الغدة الليمفاوية لليرقة ، والتي تقع عادة على بعد حوالي 1/3 من الطرف الأمامي لليرقة ، والتي قد تتألق ظهريا عبر جدار جسم اليرقة. تجنب الغدة الليمفاوية أثناء إطلاق الخلايا الدموية المقيمة عن طريق تثبيت اليرقة بإبرة في أقرب وقت ممكن من الغدة الليمفاوية لتجنب الثقب (الشكل 2 ج). < / > ملاحظه: أثناء التطور الطبيعي ، يتأخر نضج الخلايا الدموية في الغدد الليمفاوية مقارنة بالخلايا الدموية اليرقية ، وقد لا يظهر مراسلو الفلورسنت للخلايا الدموية المتمايزة إشارة في الغدد الليمفاوية لليرقات الصغيرة. في هذه الحالات ، يجب إيلاء اهتمام أقل للغدة الليمفاوية حيث لا يتوقع تلوث خلايا الدم اليرقية المتمايزة المسماة بالفلورسنت بواسطة خلايا الدم في الغدد الليمفاوية.
      3. إطلاق خلايا الدم المقيمة في عملية تشريح الكشط و / أو الضرب. استخدم نقطة إبرة واحدة لتثبيت اليرقة بشكل فعال بالقرب من الغدة الليمفاوية (انظر أعلاه) أو مناطق أخرى من الجسم حسب الحاجة. استخدم إبرة أخرى لضرب مجموعات الخلايا الدموية التي يمكن رؤيتها من خلال جدار جسم اليرقات (الشكل 2C ، E) ، بهدف فصل الخلايا الدموية. يمكن أيضا إطلاق الخلايا الدموية في حركة كشط. ومع ذلك ، فإن تمزيق البشرة مبكرا قد يطلق مجموعات كبيرة من خلايا الدم ، مما قد يجعل العد الآلي أكثر صعو><بة. ملاحظه: اعتمادا على عمر اليرقة والنمط الجيني لها ، سيختلف عدد الخلايا الدموية الإجمالية. قم بتوزيع عملية الإطلاق الموضحة أعلاه على عدة آبار لتجنب اكتظاظ بعض الآبار بخلايا الدم ، مما قد يجعل تحليل الصور أحادية الخلية أكثر صعوبة.
      4. إذا بقي عدد قليل من الخلايا الدموية في الذبيحة النهائية ، فقم بحساب هذه الخلايا الدموية عن طريق الملاحظة من خلال المجهر واستخدام عداد الإحصاء اليدوي (الشكل 2 ه). لتسهيل العد ، ضع الذبيحة على منطقة نظيفة من نفس الشريحة وانشرها بأكبر قدر ممكن لتقليل عدد المستويات الضوئية.
      5. بمجرد اكتمال التشريح ، انتظر ما بين 5 - 10 دقائق حتى تستقر الخلايا (ولكن ليس بالضرورة الالتصاق) قبل تصوير الآبار. احتضان الشريحة في غرفة رطبة لتجنب الجفاف ، وتجنب التعامل الخشن مع الشرائح ، والتي قد تزعج الخلايا الدموية المستقرة.
         ملاحظه: عند تحديد عدد الخلايا الدموية ، لا يتم إصلاح الخلايا المنبعثة ويجب تصوير الخلايا بعد فترة وجيزة من التشريح ، ويفضل أن يكون ذلك في غضون 30 دقيقة بعد إطلاقها من اليرقة. اعتمادا على حجم الوسط وخصائص الخلية ، ستستقر الغالبية العظمى من الخلايا في غضون 5-10 دقائق ، والتي يجب تأكيدها من خلال التركيز من خلال المستويات البصرية للوسط في البئر. ومع ذلك ، فإن جزءا صغيرا فقط من خلايا الدم قد التزم بسطح الشريحة بحلول هذا الوقت ، وهي حقيقة يجب مراعاتها عند تعديل هذا البروتوكول للأساليب القائمة على تثبيت الخلايا.
4. التحديد الكمي:
   1. التقط صورا للخلايا الدموية المستقرة تحت المجهر الفلوري (الشكل 2 ب ، د ، و). اتبع مع القياس الكمي للخلايا الدموية باستخدام برنامج ImageJ.
   2. قم بإعداد الصورة لخوارزمية عد خلايا ImageJ:
      1. افتح صورة البئر باستخدام ImageJ: File → افتح → (حدد موقع الملف وحدد).
      2. تأكد من أن الصورة (الصور) 8 بت أو 16 بت. اضبط الحد الأدنى للصورة عن طريق تحديد صورة، ثم انقر على ضبط وحدد الحد. لاحظ "نافذة العتبة" (الشكل 3 أ).
      3. تحقق من خيار "الخلفية الداكنة". حدد "أحمر" وقم بزيادة مستوى العتبة السفلية (انظر السهم الأسود) حتى يتم تمييز كل خلية في الصورة بنقطة حمراء (ستظهر الخلايا التي لم يتم تغطيتها بتدرج الرمادي. الشكل 3 ب). مع زيادة العتبة الدنيا ، ستصبح بعض الخلايا غير مميزة. يمكن أن يكون هذا مؤشرا على مدى تعيين العتبة الأدنى.
         ملاحظه: في بعض الأحيان لا يمكن حل مجموعات من الخلايا ويتم احتسابها كواحدة بواسطة عداد الجسيمات. في مثل هذه الحالات ، يمكن تقدير عدد الخلايا في نظام المجموعة عن طريق فحص الصورة (التكبير إذا لزم الأمر) والعد اليدوي باستخدام عداد الإحصاء. بدلا من ذلك ، يمكن زيادة العتبة السفلية لحل مجموعات الخلايا. يمكن بعد ذلك حساب أي خلايا غير مميزة ناتجة عن هذا التلاعب باستخدام عداد الإحصاء.
   3. تحليل رقم الخلية باستخدام ImageJ:
      1. قم بتشغيل محلل الجسيمات لحساب الخلايا (الشكل 3 ج). حدد تحليل وانقر فوق تحليل الجسيمات. اختياريا ، حدد "مخططات التراكب" لرؤية الجسيمات التي تحسب الخوارزمية (الشكل 3D). بدلا من ذلك ، قم بتعيين حد لحجم أو مساحة البكسل للوحدة (على سبيل المثال ، الخلية ، وكتلة الخلايا ، وما إلى ذلك) حتى تقوم الخوارزمية بالعد.
      2. انقر فوق موافق. راقب نافذة ملخصة مع العد (الشكل 3E).

< p class = "jove_title" >2. فحص اضطراب الخلايا الدموية

1. لإزعاج الخلايا الدموية ، حدد اليرقات وضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل مع ما يقرب من 0.5 غرام من الخرز الزجاجي (212-600 ميكرومتر) وأضف 0.5 مل من الماء.
2. دوامة الأنبوب ، باليد ، بسرعة 10 لمدة 1 دقيقة.
3. استرجع اليرقات من الخرز الزجاجي عن طريق سكب محتويات أنبوب الطرد المركزي الدقيق في طبق بتري والتقاط اليرقات بفرشاة الرسم.
4. لمرحلة التعافي ، ضع اليرقات في أطباق بتري المعدة مسبقا مع كميات صغيرة من طعام الذباب. اسمح لليرقات بإعادة تأسيس نمط الخلايا الدموية لمدة 45 دقيقة أو حسب الرغبة. < / > ملاحظه: تخلص من أي يرقات توقفت عن الحركة ، لأنها ماتت في هذه العملية. ومع ذلك ، فإننا عادة ما نرى ضررا طفيفا بعد دقيقة واحدة من الدوامة.
5. بعد فترة التعافي ، استمر في اختبار النزيف / الكشط كما هو موضح أعلاه في القسم 1.

النتائج

الشكل 1. إعداد فحص نزيف / كشط الاضطرابات الدموية والتخطيطي. (أ)إعداد شريحة الصورة الواحدة: خمسة مربعات مقاس 2 مم للتصوير بهدف 5X. (ب) إعداد شريحة مسح البلاط: أربعة مربعات مقاس 3 مم لتصوير نزيف/خدوش يرقات ≤2.5 مم باستخدام مجهر مسح البلاط. الأهداف الموصى بها للتصوير هي 5X أو 10X. (ج) التخطيطي لفحص النزيف / الكشط والتقديرات الكمية الناتجة باستخدام ImageJ. (د)

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أطباق بتري 6 سم / 9 سم واحد لكل نمط وراثي ليتم تقييمه زجاجة بخاخ الماء ملعقة معدنية / ملعقة فرشاة رسم رقيقة على سبيل المثال "بطانة" طبق تجويف زجاجي قلم عنق الرحم: سوبر باب PEN IM3580 بيكمان كولتر شرائح زجاجية ستحتوي كل شريحة على 5 مربعات أو أكثر من PAP PEN مرسومة عليها. يعتمد حجم المربعات على هدف التصوير وتكبير الكاميرا المجهرية. على سبيل المثال مربعات 2 مم. غرفة رطبة سيتم استخدام هذا لمنع الشرائح والآبار من الجفاف: حاوية محكمة الغلق مع مناشف ورقية مبللة تبطن الجوانب / القاع وسائط زراعة خلايا ذبابة الفاكهة شنايدر إنفيتروجين كتلة باردة هذه كتلة معدنية (تعرف أيضا باسم كتلة التسخين) مبردة في دلو يحتوي على ثلج ؛ ويفضل أن يكون اللون الأسود أو أي لون غامق آخر غير عاكس حقنتان سعة 1 مل مع إبر (27 جم 1/2) بيكتون ديكنسون للتشريح. اختياري: مقص زنبركي جراحي (حافة القطع 2 مم) أدوات العلوم الدقيقة خرز زجاجي ، 212-600 ميكرون سيغما 2 مل أنابيب Eppendorf إيبندورف واحد لكل تقييم النمط الجيني خلاط دوامة فيشر ساينتيك ذبابة الفاكهة اليرقات المعدلة وراثيا مع خلايا دموية مميزة بالفلورسنت. تشمل الجينات المعدلة وراثيا المناسبة: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al. ، 2011) ، MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al. ، 2009) ، BcF6-CFP و -GFP (Gajewski et al. ، 2007) ، أو HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot ، 2004) ، Pxn-GAL4 (Stramer et al. ، 2005) ، He-GAL4 (Zettervall et al. ، 2004) ، Crq-GAL4 (بواسطة H. Agaisse (Stramer et al. ، 2005)) ، أو eater-GAL4 (Tokusumi et al. ، 2009) جنبا إلى جنب مع UAS-GFP أو الجينات المعدلة وراثيا للبروتين الفلوري الأخرى. مجهر تشريح الفلورة لايكا هنا: Leica M205 ، اختياري مع الكاميرا وبرنامج التصوير ووحدة القياس مجهر مضان مقلوب مع مرفق الكاميرا لايكا أو كينس مع أو بدون وظيفة مسح البلاط (على سبيل المثال. سلسلة Leica DMI ، سلسلة Keyence BIOREVO BZ-9000)