تقنية تلطيخ Tetramer الببتيد-MHC-I لتحليل خلايا ذاكرة CD8+ الخاصة ب SIV

الملخص

المصدر: Gonzalez-Nieto، L.، et al. تحليل الخلايا التائية CD8 ⁺ الخاصة بفيروس نقص المناعة السيميان في المكاك الريسوسية عن طريق تلطيخ رباعي الببتيد-MHC-I. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو طريقة لتوصيف الخلايا التائية الذاكرة CD8 ⁺ الخاصة بفيروس نقص المناعة السيمياني (SIV) باستخدام رباعيات التوافق النسيجي المركب من الفئة الأولى (pMHC-I). رباعي pMHC-I عبارة عن مركب من أربعة جزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير - I مرتبطة بالببتيدات الخاصة ب SIV ومترافقة مع الفلوروفور. ترتبط هذه الرباعيات بشكل انتقائي بمستقبلات الخلايا التائية (TCRs) على خلايا CD8 ⁺ T الخاصة ب SIV ، مما يسهل توصيف هذه الخلايا.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. علاج PKI

ملاحظة: هذا اختياري ، ولكن يوصى به ل Mamu-B * 017: 01 رباعي.

1. أعد تعليق PBMC في وسط R10 بتركيز 1.6 × 10⁷ خلايا / مل.
2. أضف 50 ميكرولتر من معلق الخلية هذا إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي المقابلة. أضف 50 ميكرولتر من محلول 100 نانومتر من PKI إلى كل أنبوب.
3. دوامة كل أنبوب. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بنهاية هذه الخطوة ، يجب أن يحتوي كل أنبوب على 100 ميكرولتر من معلق الخلية يحتوي على 8.0 × 10⁵ PBMC و 50 نانومتر من PKI.
4. انتقل إلى خطوة تلطيخ رباعي pMHC-I.

فئة < p = "jove_title" >2. تلطيخ باستخدام رعيب pMHC-I المسمى بالفلوروكروم

1. قبل تحضير المزيج الرئيسي لرباعي pMHC-I ، قم بالطرد المركزي لأنابيب رباعي pMHC-I عند 20,000 × جم لمدة 15 دقيقة على الأقل عند 4 درجات مئوية. الهدف من هذه الخطوة هو حبيبات مجاميع البروتين في محلول ترام pMHC-I الذي قد يزيد من تلطيخ الخلفية. بمجرد الانتهاء من خطوة الطرد المركزي ، تجنب سحب العينات من قاع الأنبوب حيث تتراكم مجاميع البروتين.
2. قم بإعداد ما يكفي من مزيج رباعي pMHC-I الرئيسي لتلطيخ جميع الأنابيب التجريبية. قم بإعداد ما يزيد عن 15٪ من الحجم الإجمالي لهذا المزيج الرئيسي لحساب أخطاء سحب العينات.
قم
3. بتخفيف رباعيات pMHC-I في المخزن المؤقت للبقع (على سبيل المثال ، Brilliant Stain Buffer) بحيث يتم إضافة 25 ميكرولتر من مزيج رباعي pMHC-I الرئيسي إلى كل اختبار.
   1. قم بتسمية PBMC مع اثنين من رباعي pMHC-I لكل اختبار ؛ أحدهما مترافق مع allophycocyanin (APC) والآخر إلى Brilliant Violet (BV) 421.
4. أضف 8.0 × 10⁵ PBMC إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي المقابلة في حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر. إذا تعرضت الخلايا لعلاج PKI الموصوف أعلاه ، فيجب إعادة تعليقها بالفعل في 100 ميكرولتر في هذه الخطوة.
5. أضف 25 ميكرولتر من مزيج رباعي pMHC-I الرئيسي إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي المقابلة. بنهاية هذه الخطوة ، يجب أن يكون الحجم النهائي في كل أنبوب 125 ميكرولتر.
6. دوامة كل أنبوب من أجل تجانس تعليق الخلية.
7. احتضن في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. قم بإعداد كوكتيل الجسم المضاد أحادي النسيلة (mAb) الملطخ بالسطح خلال هذه الحضانة التي تستغرق 45 دقيقة.

فئة

3. تلطيخ السطح

1. قم بإعداد ما يكفي من مزيج mAb الرئيسي لتلطيخ جميع الأنابيب التجريبية. قم بإعداد ما يزيد عن 15٪ من الحجم الإجمالي لهذا المزيج الرئيسي لحساب أخطاء سحب العينات.
2. اضبط حجم المزيج الرئيسي باستخدام المخزن المؤقت للبقع بحيث يتم إضافة 50 ميكرولتر لكل اختبار.
3. للاستبعاد الصحيح للخلايا التائية غير CD8 ⁺ وتحديد المجموعات الفرعية للذاكرة ، استخدم كميات معايرة من mAbs موجهة ضد الجزيئات التالية في المزيج الرئيسي لتلوين السطح.
   ملاحظه: يتم توفير الفلوروكرومات المترافقة مع كل mAbs كمرجع: CD14 BV 510 و CD16 BV 510 و CD20 BV 510 و CD8α BV 785 و CD28 PE Cy7 و CCR7 FITC. لاحظ أن mAbs ضد CD14 و CD16 و CD20 مترافقة مع نفس الفلوروكروم (أي BV 510) حيث سيتم تضمينها في بوابة "التفريغ".
4. قم بتضمين صبغة قابلة للإصلاح لتمييز الخلايا الميتة في مزيج تلطيخ السطح الرئيسي [أي الصبغة التفاعلية الأمينية (ARD)]. تأكد من أن كاشف ARD مترافق في فلوروكروم مع طيف انبعاث مماثل لتلك المستخدمة في بوابة "التفريغ". في هذه الحالة ، استخدم ARD Aqua.
5. أضف 50 ميكرولتر من مزيج التلوين الرئيسي الموصوف في 3.1-3.4 إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي المقابلة. بنهاية هذه الخطوة ، يجب أن يكون الحجم النهائي في كل أنبوب 175 ميكرولتر.
6. دوامة كل أنبوب. احتضن في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة.
7. اغسل الخلايا بمحلول الغسيل (محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 0.1٪ من ألبومين مصل الأبقار و 0.45 جم / لتر من NaN3).
   أنذر: أزيد الصوديوم (NaN₃) مادة سامة. يمكن أن يسبب التعرض لكميات صغيرة أعراضا. تعامل مع هذه المادة وفقا للإرشادات المحددة من قبل مكتب الصحة والسلامة البيئية (EHS) في المؤسسة التي يتم فيها إجراء هذه التجارب.
8. أنابيب الطرد المركزي بوزن 510 × جم لمدة 5 دقائق. صب المادة الطافية بعناية في حاوية نفايات منفصلة. تأكد من عدم إزعاج الحبيبات.
   أنذر: لا تصب المادة الطافية في الخزانات التي تحتوي على مواد التبييض لأنها يمكن أن تتفاعل مع أزيد الصوديوم الموجود في مخزن الغسيل وتؤدي إلى تكوين غاز سام. اتصل بمكتب البيئة والصحة والسلامة في المؤسسة التي يتم فيها إجراء هذه التجارب للحصول على إرشادات حول كيفية التخلص من أزيد الصوديوم.
9. بعد الصب ، قم بتدوير الخلايا الموجودة في السائل المتبقي المحتجز في كل أنبوب.

< p class = "jove_title" >4. تثبيت الخلية

1. أضف 250 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهايد 2٪ (PFA) إلى جميع الأنابيب لإصلاح الخلايا.
   تنبيه: PFA مادة سامة. يمكن أن يسبب التعرض لكميات صغيرة أعراضا. التعامل مع هذه المادة وفقا للإرشادات المحددة من قبل مكتب البيئة والصحة والسلامة في المؤسسة التي يتم فيها إجراء هذه التجارب.
   1. نظرا لأن محلول PFA بنسبة 2٪ يجب أن يكون متساوي التوتر للخلايا ، استخدم PBS لتحضير هذا المحلول. مائة مل من محلول PFA 2٪ يكفي لتجارب متعددة. قم بدوامة جميع الأنابيب جيدا فور إضافة 2٪ PFA لمنع تكوين مجاميع الخلايا.
2. احتضن في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
3. اغسل الخلايا بتكرار الخطوات 3.7-3.9. بمجرد اكتمال هذه الخطوة ، يمكن تخزين الخلايا في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 24-48 ساعة. قبل الشروع في مرحلة النفاذية ، قم بدوامة الأنابيب جيدا.

< p class = "jove_title" >5. نفاذية الخلايا

1. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية. دوامة جميع الأنابيب.
2. احتضن في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
3. اغسل الخلايا بتكرار الخطوات 3.7-3.9.

< p class = "jove_title" >6. تلطيخ داخل الخلايا

1. قم بإعداد ما يكفي من مزيج mAb الرئيسي لتلطيخ جميع الأنابيب التجريبية.
2. اضبط مستوى الصوت باستخدام PBS أو المخزن المؤقت للبقع بحيث تتم إضافة 50 ميكرولتر من مزيج mAb الرئيسي داخل الخلايا لكل اختبار.
3. تحضير مزيج mAb الرئيسي الموصوف في 6.1 و 6.2 باستخدام كميات معايرة من mAbs موجهة ضد CD3 و granzyme B (Gzm B).
   ملاحظه: يمكن أن يؤدي تعشيق TCR بواسطة رباعيات pMHC-I إلى استيعاب CD3 ، والذي يمكن أن يتداخل مع الكشف عن الخلايا التائية + CD3 ⁺ CD8 ⁺ إذا تمت إضافة مضاد CD3 mAb إلى المزيج الرئيسي لتلوين السطح. لتجنب ذلك ، أضف مضاد CD3 mAb في هذه المرحلة ، أي بعد تنفاذ الخلايا. يتم سرد الفلوروكرومات المترافقة مع كل مللي أمبير كمرجع: CD3 PerCP Cy5.5 و Gzm B PE.
4. أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل mAb إلى الأنابيب المقابلة. احتضن في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
5. اغسل الخلايا بتكرار الخطوات 3.7-3.9. الأنابيب جاهزة للاقتناء في مقياس التدفق الخلوي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات داساتينيب أكسون ميدكيم محور العصبة 1392 يجب إعادة تعليقه في DMSO وتخزينه على الفور عند -20 درجة مئوية RPMI مع Glutamax جيبكو / لايف تكنولوجيز 61870-036 يجب تخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية FBS معطل بالحرارة جيبكو / لايف تكنولوجيز 10082-147 يجب تخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية البنسلين - ستربتومايسينب - أمفوتريسين ب لونزا 17-745 [إ] يجب تخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية DMSO ، لا مائي تقنيات الحياة د12345 يحفظ في درجة حرارة الغرفة. 5 مل أنابيب البولي بروبلين المستديرة القاع VWR 60819-728 رباعيات pMHC-I المترافقة بالفلوروكروم المعاهد الوطنية للصحة Tetramer Core أو MBL، Inc. يجب تخزينها وصيانتها عند 4 درجات مئوية. جهاز طرد مركزي عند 20,000 × جم لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام. لا تجمد. mAbs المترافق بالفلوروكروم شركات مختلفة يجب تخزينها وصيانتها عند 4 درجات مئوية. لا تجمد. طقم وصمة عار الخلية الميتة الميتة LIVE / DEAD القابل للإصلاح تقنيات الحياة ل34957 يجب تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية. أعد تعليق كل كمية في 50 ميكرولتر من DMSO قبل الاستخدام. عازلة وصمة عار رائعة BD Biosciences 563794 يجب تخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية محلول ملحي مخزن بالفوسفات VWR 97064-158 يحفظ في درجة حرارة الغرفة الألبومين البقر VWR 700011-230 يجب تخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية أزيد الصوديوم VWR 97064-646 يحفظ في درجة حرارة الغرفة. مادة سامة. لا تخلط مع المبيض. بيض VWR 89501-620 مادة كيميائية أكالة ، لا يمكن خلطها مع أزيد الصوديوم. تعامل بعناية بارافورمالدهيد علوم المجهر الإلكتروني 15714-ث كاشف قابل للاشتعال والتآكل والسام. تعامل بعناية بولي سوربات 20 (توين -20) ألفا إيسار L15029 يحفظ في درجة حرارة الغرفة حل النفاذية 2 BD Biosciences 340973 كاشف سام ومسبب للتآكل. تعامل بعناية أنابيب Sarsdet 1.5 مل أعلى المسمار VWR 72.692.005 2.0 مل DNA / RNA أنابيب ربط منخفضة إيبندورف 22431048 يفضل استخدام الأنابيب الدقيقة المعقمة خلاط دوامة خزانة السلامة الحيوية نظام تنقية المياه Milli Q Intergral EMD ميليبور ZRXQ010WW يمكن استخدام مياه من درجة البيولوجيا الجزيئية من أي مزود أجهزة الطرد المركزي الدقيقة الطرد المركزي ثلاجة 4 درجة مئوية BD LSR II BD Biosciences يجب أن يحتوي مقياس التدفق الخلوي على ليزر ومرشحات متوافقة مع لوحة التلوين المستخدمة. المياه منزوعة الأيونات رقائق الألومنيوم شركة VWR العلمية 89068-738 حاضنه يجب أن تكون قادرة على الحفاظ على درجة حرارة داخلية 37 درجة مئوية برنامج FACS Diva BD Biosciences برنامج Flowjo الإصدار 9.6 فلونجو تستخدم لتحليل ملفات FCS التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج FACS Diva أطراف Micropippette