اختبار قائم على التدفق الصفحي لدراسة التفاعلات بين الكريات البيض والخلايا البطانية

الملخص

المصدر: Vajen, T., et al. فحوصات قائمة على التدفق الصفحي للتحقيق في تجنيد الكريات البيض على الخلايا الوعائية المستنبتة والصفائح الدموية الملتصقة. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو فحصا قائما على التدفق الصفحي لتوصيف تفاعل الكريات البيض والشركاء الخلويين مثل الخلايا البطانية. توفر هذه الطريقة رؤى ديناميكية حول التصاق وموت وانتقال الكريات البيض عند تغليظها على طبقة سليمة ومتقاطة من خلايا الأوعية الدموية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. وضع العلامات الفلورية ونضح الكريات البيض (PMN أو THP-1 للإنسان و RAW264.7 أو الخلايا الوحيدة للفأر الأولية للفحص القائم على تدفق الفئران)

1. وضع العلامات الفلورية
   1. قم بتسمية الكريات البيض (1 × 10⁶ / مل) بصبغة الحمض النووي الفلوري الأخضر المنحدر للخلية (1 ميكرومتر). احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
   2. اغسل الخلايا باستخدام PBS عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بتعليق الخلايا بتركيز 0.5 × 10⁶ خلايا / مل (5 مل لكل حالة اختبار ، اعتمادا على معدل التدفق) في المخزن المؤقت للفحص.
2. تحضير مقايسة غرفة التدفق
   1. من أجل التصاق الكريات البيض على طبقة أحادية الخلية ، تخلص من وسط زراعة الخلية من الطبق ، وقم بتجميعه في غرفة التدفق. قم بتوصيل الأنبوب بالمحقنة. لتصاق الكريات البيض على الصفائح الدموية المجمدة ، قم بتوصيل الشريحة الصغيرة بالمحقنة. قم بتسخين حمام مائي مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
   2. خذ حقنة نضح (50 مل) ، وقم بتثبيت المحقنة على حامل الحقنة ، واضبط المضخة على وضع السحب. اضبط حجم المضخة على 0 مل ، واضبط القطر على 26.70 مم للحقنة سعة 50 مل.
   3. قم بتوصيل موصل لور الكوع بأحد طرفي الأنبوب. ضع مقرنة قفل لور بالمحقنة وقم بتوصيل الأنبوب بموصل لور الكوع بمقرنة قفل اللور. قم بتوصيل طرف الأنبوب الحر بغرفة التدفق.
3. نضح الكريات البيض والالتصاق
   1. من أجل التصاق الكريات البيض على طبقة أحادية الخلية ، تخلص من وسط زراعة الخلية من الطبق ، وقم بتجميعه في غرفة التدفق. قم بتوصيل الأنبوب بالمحقنة. لتصاق الكريات البيض على الصفائح الدموية المجمدة ، قم بتوصيل الشريحة الصغيرة بالمحقنة.
   2. بالنسبة لتروية الكريات البيض والالتصاق بطبقة أحادية الأوعية الدموية أو الصفائح الدموية ، ضع الأنبوب الثاني في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على عازلة للفحص واملأ الأنبوب بماصة 1 مل ، ثم اضغط على الأنبوب وقم بتوصيله بغرفة التدفق.
   3. قبل نضح الكريات البيض ، أضف 3 ملي مولار من CaCl₂ و 2 ملي مولار MgCl₂ إلى تعليق الخلية واحتضنه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
   4. مخزن المخزن المؤقت لفحص Perfuse قبل نضح الخلايا لإزالة الهواء المحتمل من الغرفة والأنابيب.
   5. أغلق نهايات الأنبوب عن طريق الضغط عليها بإحكام وتبديل الأنابيب من مخزن الفحص المؤقت إلى تعليق الخلية ، مما يمنع فقاعات الهواء من الانحباس. قم بتصفيح الخلايا بمعدل تدفق / إجهاد قص مناسب حتى وصول الخلايا الأولى.
   6. قم بتصريف الخلايا ذات معدل التدفق / إجهاد القص المناسب لمدة دقيقتين ، والتقط ما لا يقل عن 6 صور بين 2-6 دقائق من الخلايا المتدحرجة والملتصقة باستخدام مجهر تباين / مضان الطور المقلوب (على سبيل المثال ، EVOS-FL) باستخدام تكبير 100X متصل بكاميرا CCD أو CMOS ><رقمية. ملاحظة: يعتمد معدل التدفق / إجهاد القص على أبعاد غرفة التدفق ولزوجة التعريم. بالنسبة لغرفة التروية المستخدمة هنا (انظر جدول المواد):
      τ = η * 97.1 * Φ
      τ: إجهاد القص (1 دين/سم²) < / > η: اللزوجة (0.015 دين*ث / سم²)
      Φ: معدل التدفق (0.67 مل / دقيقة)
4. إزالة التصاق الكريات البيض
   1. لإزالة الالتصاق ، قم بتبديل الأنابيب من تعليق الخلية إلى عازلة الفحص عن طريق الضغط على الأنبوب ، مما يمنع فقاعات الهواء من الانحباس.
   2. افصل الخلايا عن طريق التروية باستخدام مخزن الفحص مع معدل تدفق / إجهاد قص مناسب (انظر 3.3.7 ملاحظة).
5. انتقال الكريات البيض
   1. بالنسبة لانتقال الكريات البيض ، قم بتصفير الكريات البيض (الخطوة 3) حتى تلتصق كمية كافية من الكريات البيض (~ 50 خلية / حقل عرض).
   2. استبدل تعليق الكريات البيض بمخزن مؤقت للفحص.
   3. سجل الخلايا المتحولة عن طريق الفاصل الزمني كل 10-15 ثانية لمدة 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

المواد