مقالة منهجية

تصوير رنين البلازمون السطحي الموضعي للكشف عن إفرازات البروتين من خلية واحدة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Raghu، D. et al. ، تقنية خالية من الملصقات للتصوير المكاني والزماني لإفرازات الخلية الواحدة. J. Vis. Exp.(2015)

يوضح هذا الفيديو تصوير رنين البلازمون السطحي الموضعي للكشف عن إفرازات البروتين من خلية واحدة. باستخدام إعداد الموائع الدقيقة ورقاقة البنية النانوية البلازمونية المرتبطة بالببتيد ، تكشف التغييرات في شدة الضوء المنعكس عند زاوية الرنين عن تفاعلات مع البروتينات المفرزة من خلية واحدة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. تصنيع البنية النانوية

  1. اختر أغطية زجاجية بقطر 25 مم بسماكة تقريبية تبلغ 170 ميكرومتر (رقم 1.5) كركائز للتصنيع النانوي.
  2. اغمر الغطاء في محلول سمكة الضاري المفترسة (نسبة 3: 1 من حمض الكبريتيك وبيروكسيد الهيدروجين) لمدة 6 ساعات على الأقل. اغسل الغطاء المنقوع بأسماك الضاري المفترسة بكميات وفيرة من الماء المقطر منزوع الأيونات عالي النقاء 18.2 MΩ (DDW).
    أنذر: يتفاعل حمض البيرانا بعنف مع المواد العضوية ويجب التعامل معه بحذر شديد.
  3. قم بإيداع غشاء رقيق من الكروم 10 نانومتر على الأغطية عن طريق تبخر الشعاع الإلكتروني لتجنب تأثيرات الشحن أثناء الزخرفة وتصوير الهياكل النانوية.
  4. قم بتدوير الطبقة الأولى من مقاومة الطبقة الثنائية التي تتكون من بوليمر إيثيل لاكتات ميثيل ميثاكريلات (MMA_EL6) عند 2,000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية ثم اخبزيها عند 150 درجة مئوية. قم بتدوير الطبقة الثانية من بولي ميثيل ميثاكريلات (950PMMA_A2) عند 3,000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية ثم اخبزيها على حرارة 180 درجة مئوية.
  5. قم بتصميم مقاومة الطبقة الثنائية باستخدام الطباعة الحجرية لشعاع الإلكترون (EBL) عند 25 كيلو فولت بجرعة مساحة 300 ميكرو ج/سم2. تطوير في كحول الأيزوبروبيل (IPA) / ميثيل إيزوبوتيل كيتون (MIBK): 2/1 وشطفه في IPA.
  6. قم بإيداع فيلم Ti (5 نانومتر) / Au (80 نانومتر) على الركيزة باستخدام مبخر شعاع إلكتروني.
  7. بعد ترسيب الذهب ، ارفع طبقة ثنائية البوليمر عن طريق نقع الركيزة في الأسيتون لمدة 4 ساعات.
  8. افحص الركيزة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لتأكيد شكل وحجم البنية النانوية ، وقم بإزالة الكروم المتبقي من الركيزة عن طريق الحفر الرطب باستخدام حفر CR-7 لمدة 60 ثانية في RT ، ثم اشطفه في DDW.
  9. صمم تباعدا بين مصفوفة من مركز إلى مركز يبلغ 33 ميكرومتر لترك مساحة لتصوير الخلايا بين المصفوفات. قم بتصميم الهياكل النانوية بنمط 20 × 20 لكل مصفوفة بدرجة 300 نانومتر باستخدام كاتب شعاع إلكتروني. تحتوي كل شريحة على 300 مصفوفة بأبعاد بنية نانوية نموذجية يبلغ ارتفاعها 80±2.5 نانومتر وقطر 70±2.5 نانومتر.
  10. افحص مجموعة فرعية من المصفوفات باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM) للتحقق من الحجم والتوحيد.
  11. قم بتوصيل حلقة دعم ، عادة من السيليكون ، بالجزء الخلفي من الغطاء باستخدام إيبوكسي معالج بالأشعة فوق البنفسجية.
فئة

2. تنظيف الرقائق وتطبيق طبقة أحادية التجميع

ذاتيا
  1. لتنظيف وتجديد الرقائق ، رماد البلازما بقوة 40 واط في خليط 300 mTorr من 5٪ هيدروجين ، و 95٪ أرجون لمدة 45 ثانية بعد تنظيف الغرفة لمدة 5 دقائق في نفس الظروف.
  2. قم بتشغيل الهياكل النانوية الذهبية مباشرة بعد رماد البلازما عن طريق غمر الرقاقة في محلول ثيول إيثانولي مكون من عنصرين يتكون من نسبة 3: 1 من SH- (CH2) 8-EG 3-OH (SPO) ومكون يحتوي إما على مجموعة وظيفية أمين أو كربوكسيل ، وهي SH- (CH2) 11-EG 3-NH 2 (SPN) أو SH- (CH2) 11-EG 3-COOH (SPC).
  3. اترك الرقاقة في محلول الثيول O / N لتشكيل طبقة أحادية التجميع ذاتيا (SAM).
  4. شطف الرقاقة بالإيثانول وجففها بغاز النيتروجين.
  5. إذا لزم الأمر ، قم بتخزين الشريحة الوظيفية لمدة تصل إلى أسبوعين عند 4 درجات مئوية.
  6. عندما تكون جاهزا للاستخدام ، تفاعل مع مكون SPN أو SPC مع الترابط باستخدام كيمياء اعتمادا على الترابط المفضل (انظر أدناه).
    ملاحظه: يمكن تجديد الرقائق وإعادة تشغيلها عشرات المرات. يمكن استخدام شريحة معينة لفترات تتراوح من 6 أشهر إلى أكثر من عام. يتم إعادة إنتاج الأطياف المقاسة على مصفوفة معينة بشكل موثوق بعد التجديدات المتكررة عن طريق رماد البلازما ، متبوعا بالوظائف الحيوية.
< p class = "jove_title" >3. وظائف السطح والتوصيف الحركي

ملاحظة: استخدم الشريحة الوظيفية في أداة SPR التجارية لتوصيف ثوابت المعدل الحركي بين الترابط والتحليل ، وكذلك لدراسة مقاومة SAM للارتباط غير المحدد. هناك مجموعة واسعة من معدلات التدفق وتصميمات الموائع الدقيقة التي تسمح بتشغيل السطح بكفاءة. نظرا لأن لدينا SPR متاحا تجاريا ، فقد قمنا بتوحيد معدلات التدفق الموصى بها. نلاحظ أن معدلات التدفق هذه نموذجية لجميع أدوات SPR وبالتالي فهي ليست مقيدة. أداة SPR ليست ضرورية نظرا لأنه يمكن إجراء جميع الوظائف مباشرة على رقاقة التصوير بالرنين البلازمون السطحي الموضعي (LSPR) ، لكنها قللت من عبء العمل لدينا لأنها أداة متعددة الإرسال في حين أن إعداد الموائع الدقيقة LSPR الخاص بنا ليس كذلك.

  1. قم بتشغيل شريحة ذهب مكشوفة تجارية باستخدام SAM كما هو موضح في القسم 2.
  2. في حالة استخدام SAM المستند إلى SPC ، قم بتنشيط مجموعة الكربوكسيل بمزيج 1: 1 من 133 ملي مولار من 1-إيثيل -3- (3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) كاربوديميد (EDC) و 33 ملي مولار من N-hydroxysuccinimide (NHS) في DDW لمدة 10 دقائق.
  3. اقتران مجموعة الكربوكسيل المنشط مع الجسم المضاد / الترابط المعني لمدة 300 ثانية باستخدام معدل تدفق 30 ميكرولتر / دقيقة. قم بإعداد الروابط في محلول الفوسفات الأس الهيدروجيني 6 ، عادة ، ولكن هذا يمكن أن يختلف اعتمادا على الجزيء.
  4. بعد اقتران الترابط ، يتدفق 0.1 M من الإيثانول أمين في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) كخطوة تعطيل لمدة 300 ثانية بمعدل 30 ميكرولتر / دقيقة. يساعد الإيثانولامين في تقليل الارتباط غير المحدد.
  5. إدخال التحليل المطلوب بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / دقيقة باستخدام مجموعة من التركيزات وحساب ثوابت المعدل الحركي باستخدام برنامج التحليل الحركي.
  6. إذا كان الربط غير المحدد يمثل مشكلة ، فقم بزيادة نسبة SPO إلى SPC أو SPN.

4. إعدادات LSPR العامة

  1. إعدادات المجهر:
    1. استخدم مصباح هالوجين بقوة 100 واط لإضاءة كوهلر العينة. استخدم مرشح تمرير طويل (عادة قطع 593 نانومتر) في مسار الضوء للتخلص من الأطوال الموجية التي لا تساهم في إزاحة الرنين (الشكل 1).
    2. لجمع بيانات LSPRi ، استخدم مجهرا مقلوبا مع هدف غمر الزيت 40X (1.4 NA) وكاميرا CCD مبردة كهربائيا حراريا 16 بت.
    3. ضع مقسم شعاع في منفذ إخراج المجهر للحصول على الصور والأطياف في وقت واحد.
    4. اضبط مرحلة المجهر الذي يتم التحكم في درجة حرارته على 37 درجة مئوية وقم بالتوازن لمدة 4 ساعات.
    5. قم بدمج مجموعة حضانة إضافية على المجهر لتنظيم تركيز ثاني أكسيد الكربون 2 والرطوبة عند 5٪ و 95٪ على التوالي.
  2. إعداد الرقاقة وتركيبها:
    1. قم بتشغيل شريحة LSPR كما هو موضح في القسم 2 باستخدام نسب SAM المثلى ثنائية إلى 8 مكونات المحددة من تجارب SPR.
    2. قم بتحميل الشريحة داخل حامل ميكروفلويديك مخصص على النحو التالي. ضع الرقاقة على قطعة سفلية من الألومنيوم. ضع الشريحة بين هذه القطعة السفلية وحشية سيليكون وقطعة علوية بلاستيكية شفافة. استخدم 4 مسامير لتثبيت التجميع.
    3. بالنسبة لتطبيق الثيول النموذجي القائم على SPC ، قم بإسقاط 300 ميكرولتر خليط 1: 1 من 133 ملي مولار من EDC و 33 ملي مولار من NHS في DDW لتنشيط مجموعات الكربوكسيل لمكون SPC thiol.
    4. انتظر لمدة 10 دقائق واشطف السطح يدويا باستخدام 10 ملي مولار PBS.
    5. اقتران مجموعة الكربوكسيل المنشط مع الترابط (عادة ما يكون جسما مضادا أو جزءا من الجسم المضاد) محل الأهمية عن طريق إسقاط طلاء 300 ميكرولتر من محلول الترابط.
    6. انتظر لمدة 30 دقيقة واشطفها يدويا باستخدام 10 ملي مولار PBS.
    7. قم بإسقاط 300 ميكرولتر من 0.1 M من الإيثانول أمين في PBS على الرقاقة لتقليل الارتباط غير المحدد. انتظر لمدة 10 دقائق.
    8. اغسل الإيثانول أمين باستخدام PBS الذي يحتوي على 0.005٪ Tween 20 (PBS-T20).
    9. ضع قطعة كوارتز فوق الرقاقة لتقليل التقلبات في البيانات المتعلقة بتغيير الغضروف المفصلي.
    10. حافظ على الشريحة مبللة باستخدام المخزن المؤقت PBS-T20 أثناء تركيبها على المجهر.
    11. ضع مجموعة شريحة LSPR بإحكام في حامل عينة المرحلة الساخنة وقم بتوصيل أنابيب الموائع الدقيقة.
    12. قم بتوصيل أنبوب الموائع الدقيقة بالمخزن المؤقت للتجميع والتدفق (أو الوسائط الخالية من المصل لدراسات الخلايا) حتى يتم الوصول إلى حالة مستقرة.
    13. اسمح للتجميع والمجهر بالتوازن لمدة 2 ساعة على الأقل.
    14. قم بمحاذاة الشريحة باستخدام عصا التحكم بحيث تتم محاذاة المصفوفة المركزية مع الألياف الضوئية للتحليل الطيفي. يتم أخذ البيانات الطيفية باستخدام مقياس الطيف وبرنامج التحليل الطيفي.
    15. حافظ على تركيز المصفوفات طوال التجربة باستخدام التركيز البؤري التلقائي للبرنامج أو Zeiss Definite Focus أو جهاز ضبط تلقائي للصورة مكافئ.
فئة

5. تصوير LSPR للإفرازات المضادة ل c-myc من خلايا الورم الهجين 9E10

ملاحظة: يعبر خط خلايا الورم الهجين المستخدم في هذه الدراسة عن الأجسام المضادة ل c-myc بشكل أساسي وبالتالي لا يتطلب محفزا كيميائيا

  1. وظيفية الهياكل النانوية باستخدام الببتيد c-myc. هذا له قيمةKD تبلغ 1.77 نانومتر للأجسام المضادة المضادة ل c-myc التي تفرزها خلايا الورم الهجين 9E10 المستنسخة.
  2. زراعة خلايا الورم الهجين في وسط نمو كامل باستخدام مصل بقري جنيني 10٪ ومضاد حيوي 1٪ في قارورة T75 عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. حافظ على كثافة خلية 4 ×105 خلايا / مل.
  3. بالنسبة لدراسات إفراز الخلايا ، تغسل خلايا الحبيبات من قارورة T75 عن طريق الطرد المركزي مرتين باستخدام وسائط RPMI-1640 الخالية من المصل (SFM) لإزالة الأجسام المضادة المفرزة وضبط كثافة الخلية إلى 4 ×106 خلايا / مل.
  4. احصد الخلايا واختبر صلاحيتها قبل إدخالها على رقائق LSPR.
  5. أدخل 50 ميكرولتر من محلول الخلية يدويا على رقائق LSPR باستخدام ماصة دقيقة. بعد بضع دقائق ، تلتصق 25 إلى 50 خلية بسطح رقائق LSPR.
  6. اغسل الخلايا المتبقية في المحلول باستخدام SFM الطازج باستخدام نظام التروية الدقيقة.
  7. حدد مصفوفات LSPR للتصوير القريبة، في حدود 10 ميكرومتر، ولكنها لا تتداخل مع الخلايا.
  8. للتأكد من أن الإشارة خاصة بالأجسام المضادة المفرزة المضادة ل c-myc ، أدخل وسط زراعة الخلية مع وبدون الأجسام المضادة الموجودة وكذلك مع الأجسام المضادة ولكن مع حظر مواقع الارتباط الخاصة بها بوجود تركيز مشبع من ببتيد c-myc في المحلول.
  9. قم بمعايرة المستشعرات في نهاية كل جولة بمحلول مشبع من الأجسام المضادة ل c-myc (250 نانومتر). يساعد هذا في تطبيع استجابة المستشعرات وتحديد الإشغال الجزئي بناء على ملف تعريف الوظيفة الحيوية لكل تشغيل.
  10. قم بتصحيح الانجراف في اتجاه X و Y باستخدام برنامج محاذاة الصور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1.الإعداد البصري.يتم ترشيح الضوء المضيء من مصباح الهالوجين أولا بواسطة مرشح التمرير الطويل (LP). الضوء مستقطب خطيا (P1) ويضيء العينة عبر هدف 40X / 1.4 NA. يتم جمع الضوء المتناثر بواسطة الهدف ويمر عبر مستقطب متقاطع (P2). يتم إدخال مقسم شعاع 50/50 (BS) في مسار الضوء الذي تم جمعه لتحليل طيفي وصور متزامن. أعلى اليمين: صورة مجهرية للقوة الذرية ل 9 هياكل نانوية فردية مفصول...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أغطية زجاجية قطرها 25 مم أدوات العلوم البيولوجية CSHP-رقم 1.5-25 170±5 ميكرومتر هو الأمثل بولي ميثيل ميثاكريلات ميكروكيم PMMA 950 A4 إيثيل لاكتات ميثيل ميتاكريلات ميكروكيم MMA EL6 مبخر شعاع الإلكترون تيميسكال FC-2000 الطباعة الحجرية لشعاع الإلكترون ريث السلسلة 150 ايثانول سيجما ألدريتش 459836 أسيتون سيجما ألدريتش 320110 حفر الكروم CR-7 سيانتيك CR-7 مسح المجهر الإلكتروني زييس الترا 55 مجهر القوة الذرية فيكو المنظار النانوي الثالث نظام رماد البلازما التقنيات سلسلة 85 RIE SH- (CH2) 8-EG3-OH (SPO) بروشيميا TH 001-m8.n3-0.2 SH- (CH2) 11-EG3-COOH (SPC) بروشيميا TH 003 م 11 ن3 - 0.1 SH- (CH2) 11-EG3-NH2 (SPN) بروشيميا TH 002-m11.n3-0.2 نظام رنين البلازمون السطحي بيوراد إكس بي آر 36 رقاقة ذهبية عارية بيوراد شريحة GLC رماد البلازما لإزالة طبقة أحادية 1-إيثيل -3- (3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) كاربوديميد الحراريه هاتف: 22980 N-hydroxysuccinimide (NHS) الحراريه هاتف: 24510 بنتيلامين - بيوتين الحراريه هاتف: 21345 الإيثانولامين سيجما ألدريتش E9508 نيوترافيدين الحراريه 31000 محلول ملحي مخزن بالفوسفات الحراريه هاتف: 28374 توين 20 سيجما ألدريتش ص2287 مجهر مقلوب زييس أكسيو أوبزرفر تم تجهيز المجهر بهدف غمر الزيت 40X ؛ حضانة CO2 والرطوبة من Pecon GmbH كاميرا CCD هاماماتسو أوركا R2 مبرد كهربائيا حراريا (16 بت) مطياف بصريات المحيط كيو إي65 برو سبيكتراسويت بصريات المحيط الإصدار1.4 علامة الببتيد C-MYC HyNic سولولينك SP-E003 الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل C-MYC سيجما ألدريتش م 4439 خط خلايا الورم الهجين ATCC [رل-1729] محلول مضاد حيوي مضاد للفطريات (100×) سيجما ألدريتش أ 5955 وسائط خالية من المصل RPMI 1640 إنفيتروجين 11835-030 مصل الأبقار الجنينية ATCC 30-2020 الرودامين DHPE تقنيات الحياة [ل-1392]

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة