Method Article

تحليل العلاقة المستضدية بين الفيروسات باستخدام مقايسة التحييد الدقيق المستندة إلى الصور

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Lin، Y.، et al. تحسين مقايسة التحييد الدقيق الكمي. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو مقايسة التحييد الدقيق المستندة إلى التصوير لتحليل العلاقات المستضدية بين فيروسات الأنفلونزا A و B. يوفر طريقة كمية ومرئية لتقييم فعالية الأجسام المضادة أو العلاجات الأخرى في الوقاية من العدوى الفيروسية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. معايرة الفيروس

ملاحظة: اعتمادا على عدد الفيروسات وعدد التكرارات ، يمكن إعداد لوحة بئر مع المرونة التالية: (1) يمكن ترتيب التخفيف الفيروسي على طول الصفوف أو الأعمدة (الشكل 1). يجب أن يشغل كل فيروس صفا / عمودا منفصلا. (2) زيادة التخفيف الفيروسي مرنة ، ولكن يجب أن تبدأ بأعلى تركيز فيروسي في الزاوية العلوية اليسرى. (3) لا توجد قيود على عدد التكرارات.

  1. Aliquot ما يكفي من خلايا MDCK أو خلايا MDCK-SIAT8 في ألواح 96 بئرا (200 ميكرولتر / بئر). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 2 أو 3 أيام للوصول إلى التقاء. نشر الخلايا في DMEM المكمل بمصل ربلة الساق الجنينية المعطل بالحرارة بنسبة 10٪ والمضادات الحيوية (100 وحدة / مل بنسلين و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين). احتضان خلايا SIAT عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و 1 مجم / مل كبريتات G418.
    ملاحظه: يعتمد عامل التخفيف على الخبرة وخط الخلية المستخدم. يجب أن تكون الطبقة الأحادية للخلية متقاربة (أي عدم وجود جدار خلوي أو مخطط مرئي لخلايا MDCK وتخطيط معبأ بإحكام لخلايا MDCK-SIAT1) في وقت تلقيح الفيروس. يتم إعطاء أمثلة على التخفيفات القائمة على الزراعة الفرعية للقوارير المتقاربة لخلايا MDCK أو MDCK-SIAT1 في الجدول 1.
  2. اغسل الخلايا 3 مرات ب 200 ميكرولتر من وسط نمو الفيروس (VGM) لكل بئر. قم بتعقيم غسالة الألواح متعددة الجدران بنسبة 70٪ EtOH لمدة 30 دقيقة ، ثم اشطفها بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) أو VGM قبل الغسيل.
  3. استنشق VGM وأضف على الفور 50 ميكرولتر من VGM إلى كل بئر.
  4. أضف 900 ميكرولتر من VGM إلى كل من 6 أنابيب معقمة (أو أقل ، اعتمادا على عدد فيروسات الاختبار والتكرارات). ماصة 100 ميكرولتر من الفيروس في الأنبوب الأول ، واخلطها جيدا ، وتخفف بشكل متسلسل ، مع تغيير الأطراف بين كل تخفيف. كرر ذلك لكل فيروس ليتم معايرة حجمه.
    ملاحظه: سيعطي هذا تخفيفات الفيروس من 10-1 إلى 10-6.
  5. أضف 50 ميكرولتر من كل تخفيف للفيروس ، بدءا من أعلى تخفيف (1 × 10-5 في الشكل 1) ، إلى الآبار المكررة (العمودان 9 و 10 في الشكل 1) من صفيحة مكونة من 96 بئرا.
  6. ضع اللوحة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعات للسماح للفيروس بإصابة الخلايا.
    ملاحظه: من الضروري إجراء حضانة لمدة 2 إلى 3 ساعات للتأكد من أن الفيروسات الموجودة في اللقاح لديها الوقت الكافي للوصول إلى الطبقة الأحادية.
  7. تحضير التراكب (10 مل / لوحة)
    ملاحظه: يتكون التراكب من 5 مل من 2x DMEM ، والتربسين (2 ميكروغرام / مل التركيز النهائي) ، و 20 ميكرولتر من 1 مجم / مل من المرق ، و 5 مل من القطن السليلوز (انظر قائمة المواد).
  8. قم بإزالة اللقاح.
  9. أضف التراكب (200 ميكرولتر لكل بئر). احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، دون إزعاج.
    ملاحظه: يحدث تبرعم الفيروس بعد حوالي 4 ساعات ، لذلك من المهم عدم إزعاج اللوحة بعد هذا الوقت.
  10. استنشق التراكب من الآبار.
  11. أضف 4٪ بارافورمالدهيد مثلج في PBS A (200 ميكرولتر / بئر). ضعها على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة < / > ملاحظة: PBS A عبارة عن محلول ملحي طبيعي مخزن بالفوسفات بدرجة الحموضة مع 10 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.25 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1.437 جم من Na2HPO4 ، و 0.25 جم من KH2PO4 ، و 1 لتر من الماء المقطر (انظر قائمة المواد).
    ملاحظة: بارافورمالدهيد ضار عند استنشاقه ويمكن أن يسبب حروقا إذا ابتلع. هناك أيضا أدلة محدودة على وجود تأثير مسرطن ، وقد يسبب التحسس بعد ملامسة الجلد.
  12. قم بشفط البارافورمالدهيد وغسل الألواح مرتين باستخدام PBS A (200 ميكرولتر / بئر).
  13. قم بتخزين الأطباق في PBS A عند 4 درجات مئوية للاستخدام في المستقبل ، أو استمر في الخطوات التالية.
  14. أضف مخزن مؤقت للنفاذية (100 ميكرولتر / بئر). اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  15. اغسل الطبق مرتين باستخدام PBS A (200 ميكرولتر / جيدا).
  16. أضف 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الأول ، الفأر MAb ضد الأنفلونزا من النوع A (1: 1,000 في ELISA Buffer) ، لكل بئر. احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة (أو 4 درجات مئوية طوال الليل) ، مع الرج.
  17. اغسله 3 مرات في 100 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت (0.05٪ Tween 80 في PBS A ، v / v) لكل بئر. احتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق بين الغسل. بالتناوب ، اغسله 3 مرات دون حضانة باستخدام 300 ميكرولتر لكل بئر.
  18. أضف 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الثاني ، الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) HRP المترافق (1: 1,000 في ELISA Buffer) ، لكل بئر. احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، مع الرج.
  19. اغسله 3 مرات كما هو موضح في الخطوة 1.17.
  20. أضف الركيزة (50 ميكرولتر / بئر). احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أو حتى يظهر اللون الأزرق بوضوح.
  21. لإيقاف التفاعل ، اغسل الطبق مرتين ب 200 ميكرولتر من الماء المقطر لكل بئر ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق بين الغسيل.
  22. جفف الطبق بالهواء واحفظه في مكان مظلم (على سبيل المثال ، لفه بورق الألمنيوم).

2. تحييد الفيروسات

ملاحظة: احسب عدد اللوحات المطلوبة لمقايسة التحييد. يمكن أن تستوعب كل لوحة فيروسا واحدا وعددا من مضادات الأمصال.

ملاحظة: اعتمادا على عدد الأمصال المضادة وعدد التكرارات ، يمكن إعداد صفيحة البئر مع المرونة التالية: (1) يمكن ترتيب تخفيف المصل إما على طول صف أو عمود (الشكل 2). يجب أن يشغل كل مصل صفا أو عمودا منفصلا. (2) زيادة تخفيف المصل مرنة ، ولكن يجب أن تبدأ بأعلى تركيز مصل في الزاوية العلوية اليسرى من اللوحة. (3) عدد التكرارات يوازن عدد antisera. يمكن أن يساعد المزيد من التكرارات في تخفيف الاختلافات التجريبية. (4) عدد VC وعدد التكرارات المكررة لتحكم الخلية (CC) مرنة ، ولكن يجب أن يكونا أيضا في صفوف أو أعمدة منفصلة. من المتوقع أن يكون عدد نسخ VC المكررة أكبر بكثير من عدد مضاد الأصل.

  1. قم بإعداد طبقة أحادية الخلية ، كما في الخطوات 1.1-1.3 ، 2 أو 3 أيام مقدما.
  2. أضف 50 ميكرولتر من VGM إلى كل بئر من اللوحة.
  3. استخدم العمودين 11 و 12 ل VC و CC ، على التوالي. أضف 50 ميكرولتر من المصل المعالج بالإنزيم المدمر للمستقبلات (RDE) 1:20 إلى الصف الأول (A) من الأعمدة 1-10.
    ملاحظه: لكل مجموعة من الفيروسات والمصل ، يتم إجراء الفحص في نسختين ، لذلك قد تحتوي لوحة واحدة ، على سبيل المثال ، على فيروس واحد تم اختباره ضد خمسة مضادات الأصل.
  4. قم بإجراء تخفيفات تسلسلية 2 أضعاف عن طريق نقل 50 ميكرولتر من الصف A إلى الصف H (الأعمدة 1-10 في الشكل 2) والتخلص من 50 ميكرولتر من الصف H.
  5. أضف 50 ميكرولتر من المخفف إلى كل بئر من عمود CC (العمود 12 في الشكل 2).
  6. أضف 50 ميكرولتر من الفيروس إلى كل بئر من اللوحة ، باستثناء عمود CC (الأعمدة 1-11 ، الصفوف A-H في الشكل 2).
  7. احتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعات. أضف التراكب (200 ميكرولتر) إلى كل بئر. احتضنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، دون إزعاج. قم بإصلاح الألواح وصخها كما هو الحال بالنسبة لمعايرة الفيروس (الخطوات 1.11-1.22).
< p class = "jove_title" >3. القياس الكمي للتحييد

  1. ضع لوحة بئر في منطقة المسح الضوئي للماسح الضوئي المسطح ، كما هو موضح في الشكل 2 أ. استخدم حد موضع الشكل L لضمان موقع تصوير مثالي وقابل للتكرار.
    ملاحظه: من الممكن تصوير لوحين جيدا في مسح واحد.
  2. امسح اللوحة.
  3. قم بتشغيل برنامج "Wellplate Reader" لحساب العيارات الفيروسية المطلوبة (الشكل 3).
    1. انقر فوق الزر "تحميل صورة" لتحميل صورة. حرك الشريط الأحمر في "العتبة العالمية" لضبط عتبة أخذ العينات. انقر فوق الزر "تحديث" لفحص التأثير.
    2. ضع علامة في مربع "حساب التحييد/المعايرة بالتحليل الحجمي". انقر فوق الزر "أخذ العينات" لتحديد كمية برنامج المقارنات الدولية. انقر فوق الزر "حفظ" لحفظ نتائج أخذ العينات عندما يطلب منك ذلك.
      ملاحظه: بعد عملية أخذ العينات، تظهر نافذة جديدة تسمى "حساب التحييد والمعايرة بالتحليل الحجمي" تلقائيا إذا تم تحديد مربع "حساب التحييد/المعايرة بالتحليل الحجمي".
    3. قم بتحميل أو إدخال خريطة لوحة البئر. حدد العتبة (على سبيل المثال ، 50٪) في "التحييد: خصم العدوى (٪)".
    4. حدد "عملية التحييد" لحساب العيارات. تحقق من العيارات وانقر فوق الزر "حفظ وإغلاق" لحفظ نتائج التحييد.
      ملاحظه: يتم الإبلاغ عن التحييد على أنه متبادلة لأعلى تخفيف للمصل مع تقليل برنامج المقارنات الدولية المحدد مسبقا (مثل 50٪ أو 80٪) مقابل VC (متوسط العمود 11 في الشكل 4. واستخدم تخفيض برنامج المقارنات الدولية بنسبة 50٪ في النتائج التمثيلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: مثال على إعداد لوحة البئر في تجربة معايرة الفيروس. يتم تعيين فيروسات الاختبار لصفوف منفصلة (من A إلى H). تم تصميم الأعمدة للتخفيفات الفيروسية المختلفة (من 1 إلى 12). تم استخدام عمودين كنسخ مكررة لكل تخفيف فيروسي. شريط المقياس = 10 مم.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments VGM سيغما D6429 ، P0781 500 مل DMEM + 5 مل قلم / ستريب برنامج تلفزيوني أ الطبيعة درجة الحموضة محلول ملحي مخزن بالفوسفات: كلوريد الصوديوم 10 جم ، كلوريد كلوريد الصوديوم 0.25 جم ، Na2HPO4 1.437 جم ، KH2PO4 0.25 جم ، وحي الماء 1 لتر أفيسيل إف إم سي RC-581F 2.4 جم في 100 مل من الماء المقطر المذاب عن طريق التحريك على محرك مغناطيسي لمدة 1 ساعة. تعقيم عن طريق التعقيم 2x DMEM جيبكو 21935-028 التربسين سيغما تي 1426 تراكب (10 مل / طبق): 5 مل 2 × DMEM ، التربسين 2 ميكروغرام / مل التركيز النهائي ، أفيسيل 5 مل تريتون X- 100 ه سيغما تي 8787 المخزن المؤقت للنفاذية: 0.2٪ في PBS A (حجم / حجم) توين 80 سيغما ص 5188 المخزن المؤقت للغسيل: 0.05٪ Tween 80 في PBS A (حجم / حجم) مصل الحصان مختبرات PAA المحدودة ب 15-021 المخزن المؤقت ELISA: 10٪ في PBS A (حجم حجمي / حجم) + 0.1٪ Tween 80 الفأر MAb ضد الأنفلونزا من النوع A بيوراد MCA 400 1 الأجسام المضادة: 1: 1,000 في ELISA Buffer الماعز المضادة للفأر IgG (H + L) HRP مترافقة بيوراد 172-1011 2 الأجسام المضادة: 1: 1,000 في ELISA Buffer الركيزة الحقيقية بلو بيروكسيداز KPL 50-78-02 المادة المتفاعلة: أزرق حقيقي + 0.03٪ H2O2 جم (1: 1،000 من محلول 30٪) ألواح ميكروتيتر مسطحة القاع سعة 96 بئر كوستار 3596 ريال 8 قنوات غسالة لوحة متعددة الجدران ومشعب سيغما M2656 الماسح الضوئي لوحة الكمال إبسون V750 برو يمكن تنزيل برنامج التصوير مجانا من http://www.epson.com/cgi-bin/ Store / support / supDetail.jsp? oid = 66134 &infoType = Downloads. بيئة تشغيل البرمجيات: LabVIEW المؤسسة الوطنية للأدوات نافذة قائمة على NI Vision builder الإصدار: LabVIEW2012 أو أعلى

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Micro neutralization AssayVirus NeutralizationAntigenic RelationshipInfluenza VirusReceptor destroying EnzymeSerial DilutionCell MonolayerOverlay TechniqueVirus infected CellsNeutralization Titer

Related Articles