القياس الكمي لنشاط عزل البلغم الذاتي السائب في خلايا الثدييات

الملخص

المصدر: Luhr ، M. et al. ، مقايسة عزل نازعة هيدروجين اللاكتات - طريقة بسيطة وموثوقة لتحديد نشاط عزل البلاعم الذاتي السائب في خلايا الثدييات. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح الفيديو فحصا لتقييم نشاط العزل الذاتي السائب في خلايا الثدييات. يستخدم التثقيب الكهربائي لإطلاق بروتينات العصارة الخلوية ، بما في ذلك نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH). يتم تحديد LDH المعزولة وكسور LDH الخلوية الكلية لتقييم عزل LDH ، مما يوفر رؤى حول نشاط العزل السائب الكلي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. بذر الخلايا ومعالجتها

1. زراعة الخلايا الملتصقة في قوارير زراعة الأنسجة 75 سم² في حاضنة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية ، باستخدام وسط الثقافة المفضل لنوع الخلية المعنية. اسمح للخلايا بالنمو حتى تصل إلى طبقة خلية قريبة من التقاء. < / > ملاحظه: استخدم وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 المكمل بمصل بقري الجنين بنسبة 10٪ (FBS) لخلايا LNCaP و HEK293 والخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs) و BJ و MCF-7 و RPE-1.
   1. اغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 3 مل 37 درجة مئوية (PBS) ، درجة الحموضة 7.4. استبدل PBS ب 3 مل 0.25٪ (وزن / حجم) Trypsin-ethylenediaminetetraacetate (EDTA) ، واحتضان القارورة في حاضنة مرطبة مع 5٪ CO₂ عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا (2-5 دقائق).
   2. أعد تعليق الخلايا المنفصلة بوسط ثقافة سعة 7 مل يحتوي على 10٪ FBS. امزج كمية معلق خلية سعة 10 ميكرولتر مع 10 ميكرولتر 0.4٪ Trypan Blue في أنبوب طرد مركزي دقيق ، باستخدام طرف ماصة 0.5-20 ميكرولتر. استخدم نفس طرف الماصة لملء شريحة غرفة العد على الفور، وعد الخلايا في عداد خلوي آلي.
2. قم بإعداد تخفيف مناسب (انظر الملاحظة أدناه) لتعليق الخلية من الخطوة 1.1.2 باستخدام وسط مزرعة يحتوي على 10٪ FBS ، وبذرة 1 مل من تعليق الخلية المخفف في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا (مساحة السطح ~ 3.8 سم²) باستخدام تقنية معقمة. السماح بالنمو في حاضنة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} عند 37 درجة مئوية حتى يتم الوصول إلى كثافة الخلايا المطلوبة ، على سبيل المثال ، التقاء 60-90٪ عند الحصاد. < / > ملاحظه: سيختلف التخفيف المناسب لتعليق الخلية الذي سيعطي التقاء الخلية المطلوب عند الحصاد من نوع الخلية إلى نوع الخلية ، وكذلك وفقا لمدة ونوع العلاجات التجريبية. وبالتالي ، يجب تقييم ذلك تجريبيا في كل حالة.
   1. بالنسبة للتجارب التي سيتم معالجتها وحصادها بعد يومين من البذر ، قم بالبذور 2.5 × 10⁵ LNCaP أو HEK293 أو MCF-7 ، أو 5 × 10⁴ MEFs ، أو 4 × 10⁵ BJ ، أو 1.5 × 10⁵ خلايا RPE-1 في كل بئر من اللوحة المكونة من 12 بئرا.
   2. بالنسبة للخلايا التي تلتصق بشكل فضفاض ، قم بتغطية الألواح بنوع الطلاء الموصى به لنوع الخلية المعنية. بالنسبة لخلايا LNCaP (و HEK293) ، استخدم لوحات مطلية ب poly-D-lysine (PDL).
   3. تحقيقا لهذه الغاية ، أضف 500 ميكرولتر PDL عند 2.5 ميكروغرام / مل في H₂O معقم إلى كل بئر ، واحتضان الألواح في بيئة معقمة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية). قم بإزالة PDL بالشفط ، واغسل كل منهما جيدا لفترة وجيزة ب 1 مل معقم H₂O.
      ملاحظه: بشكل عام ، تتم الخطوة 1.2.1 دون أي علاجات تجريبية. ومع ذلك ، في حالة إجراء RNAi ، قد يكون من المناسب بدء تعداء عكسي مع البذر.
3. إجراء العلاجات التجريبية في آبار مكررة أو ثلاثية لكل حالة.
   1. على سبيل المثال ، عالج الخلايا ب 50 نانومتر من مثبط mTOR Torin1 ، والذي يعد بشكل عام محفزا فعالا للعزل الذاتي ، أو قم بإخضاع الخلايا لتجويع الأحماض الأمينية والمصل الحاد عن طريق غسل الخلايا ب 1 مل من وسط محلول الملح المتوازن إيرل الخالي من الأحماض الأمينية (EBSS) ، ثم احتضان الخلايا في 1 مل من EBSS في حاضنة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂) عند 37 درجة مئوية.
   2. اترك مجموعة واحدة من الآبار دون معالجة من أجل تحديد مستويات خلفية نازعة هيدروجين اللاكتات القابلة للترسيب (LDH).
   3. أضف كمية مشبعة من مثبط ما بعد العزل بافيلومايسين A1 (Baf) في حالة عدم وجود العلاجات التجريبية أو وجودها ، قبل 3-4 ساعات من حصاد الخلايا. احتضان الخلايا في حاضنة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية.
      1. استخدم 100 نانومتر BAF لخلايا LNCaP و HEK293 و BJ و MCF-7 و RPE-1 و 10 نانومتر Baf ل MEFs.
      2. بالنسبة للعلاجات التجريبية التي تتراوح مدتها من 3 إلى 4 ساعات فقط (مثل تلك الموضحة في الخطوة 1.3.1 عادة) ، أضف Baf في وقت واحد مع العلاجات. للعلاجات التجريبية الأطول ، انتظر حتى 3-4 ساعات قبل الحصاد ، وأضف 2 ميكرولتر من مخزون Baf المركز 500x مباشرة في الوسط.
      3. تخلط عن طريق تحريك الطبق مباشرة بعد إضافة Baf. في هذه المرحلة ، يوصى أيضا بإضافة مثبطات عزل البلجي الذاتي كعناصر تحكم ، على سبيل المثال ، 10 ملي مولار من مثبط عموم الفوسفوينوزيتيد 3-كيناز (PI3K) 3-ميثيل الأدينين (3MA) ، أو 10 ميكرومتر من مثبط PI3K الانتقائي من الفئة الثالثة SAR-405.

< p class = "jove_title" >2. حصاد الخلايا والتحضير للتعطيل الكهربائي

1. في نهاية فترة العلاج ، قم بشفط الوسط بالشفط وأضف محلول انفصال الخلايا 200 ميكرولتر (مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية) إلى كل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا (عادة حوالي 5 دقائق).
   ملاحظه: في حين يمكن استخدام 0.25٪ (وزن / حجم) Trypsin-EDTA بدلا من محلول انفصال الخلية ، فإن الأخير يحتوي على DNase ، مما يساعد على تقليل لزوجة الخلايا المنفصلة. وطالما أن الوسط يتم شفطه جيدا، فليس من الضروري غسل الخلايا قبل إضافة التربسين EDTA أو محلول انفصال الخلية.
2. أضف 500 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) PBS ، درجة الحموضة 7.4 ، تحتوي على 2٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقر (BSA) لكل بئر ، وأعد تعليقها باستخدام الماصة حتى لا تظهر كتل الخلايا. انقل تعليق الخلية على الفور إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل على الجليد. < / > ملاحظه: ما لم ينص على خلاف ذلك ، قم بتنفيذ جميع الخطوات اللاحقة على الجليد.
3. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
4. شفط المادة الطافية جيدا (مع الشفط) لترك كريات الخلية جافة قدر الإمكان.
5. أضف 400 ميكرولتر 10٪ (وزن / حجم) سكروز (في H₂O) فائق النقاء إلى كل أنبوب.

فئة

3. التعطيل الكهربائي لغشاء البلازما وفصل كسور الخلايا القابلة للترسيب والكلية

1. أعد تعليق حبيبات الخلية بماصة للحصول على تعليق قريب من خلية واحدة ، وانقلها إلى كوفيت كهربائي 4 مم.
   ملاحظه: عادة ما يكون سحب الأنابيب لأعلى ولأسفل ~ 10-15 مرة ، باستخدام طرف ماصة 100-1,000 ميكرولتر ، كافيا.
2. ضع الكوفيت في مثقب كهربائي لموجة الاضمحلال الأسية ، وقم بتفريغ نبضة كهربائية واحدة عند 800 فولت و 25 ميكروفهرنهايت و 400 Ω ؛ تنتج هذه الإعدادات نبضة تبلغ ~ 8 مللي ثانية.
3. استخدم طرف ماصة جديد لنقل خلية التعطل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 400 ميكرولتر محلول سكروز مخزن بالفوسفات البارد (100 ملي مولار أحادي فوسفات الصوديوم ، 2 ملي مولار ديثيوثريتول (DTT) ، 2 ملي مولار EDTA ، 1.75٪ سكروز ، درجة الحموضة 7.5) ، واخلطه لفترة وجيزة عن طريق سحب العينات.
   1. اختياري: للتحقق من الاضطراب الكهربائي الفعال لغشاء البلازما، امزج 10 ميكرولتر من الخلية المخففة من الخطوة 3.3 مع 10 ميكرولتر 0.4٪ Trypan Blue في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. انقله إلى غرفة العد وتحقق من أن النسبة المئوية للخلايا الموجبة ل Trypan Blue هي >99٪.
      1. اترك العينة في غرفة العد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) ، وتحقق من أن النسبة المئوية للخلايا الموجبة ل Trypan Blue ظلت >99٪.
   2. اختياري: للتحقق من أن الاضطراب الكهربائي لم يكن قاسيا للغاية ، أي أنه لم يعطل العضيات داخل الخلايا ، قم بتنفيذ الخطوات 1.1-3.3 كما هو موضح أعلاه ، ولكن استخدم مادة أولية أكبر (بئر من صفيحة 6 آبار مع طبقة خلية ملتاقة ~ 80٪) ، واستخدم 150 ميكرولتر 10٪ سكروز في الخطوة 2.5 و 150 ميكرولتر محلول سكروز مخزن بالفوسفات بدون DTT في الخطوة 3.3.
      1. استخدم ماصة لوضع طبقة بعناية 200 ميكرولتر من محلول تعطيل الخلية المخففة فوق وسادة كثافة 1.2 مل من وسط تدرج الكثافة 8٪ (وزن / حجم) مخزن بالفوسفات (على سبيل المثال ، 8٪ Nycodenz ، 50 ملي فوسفات الصوديوم ، 2.2٪ سكروز ، 1 ملي مولار EDTA) في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل. جهاز طرد مركزي عند 20,000 × جم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي دقيق مع وظيفة الوضع الناعم (للتسارع والتباطؤ اللطيفين) ، ووضع الأنابيب بعناية على الجليد.
      2. قم بإزالة 60 ميكرولتر بعناية من الجزء العلوي ~ 200 ميكرولتر ، مع التأكد من عدم التقاط أي محلول متوسط متدرج كثافة ، ونقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. < / > ملاحظه: يجب أن يحتوي هذا على العصارة الخلوية ذات النقاء الاستثنائي ، والتي تسمى "عصارة الخلية".
      3. اختبر نقاء الكسر الذي تم الحصول عليه في الخطوة أعلاه ، من خلال إجراء تحليلات اللطخة الغربية للبروتينات المحتوية على العضيات ، باستخدام التقنيات القياسية والمواد الهلامية المتدرجة بنسبة 4-20٪.
      4. قم على سبيل المثال بإجراء النشاف المناعي للقسطرسين B ، والسيتوكروم ج ، وأيزوميراز ثاني كبريتيد البروتين ، للتحقق من أن الصدمة الكهربائية في الخطوة 3.2 لم تعطل الجسيمات الحالة أو الميتوكوندريا أو الشبكة الإندوبلازمية ، على التوالي ، واللطخة المناعية ل LDH للتحقق من وجود بروتين العصارة الخلوية في عصارة الخلية.
      5. في موازاة ذلك ، قم بإجراء النشاف المناعي على مستخلصات البروتين المصنوعة من محلول تعطيل الخلية الكلي للتأكد من أن الأجسام المضادة المستخدمة يمكنها اكتشاف البروتينات المحتوية على العضية التي يتم تقييمها.
4. كرر الخطوات 3.1-3.3 لكل عينة.
5. قم بإزالة 550 ميكرولتر من كل محلول مخفف لتعطيل الخلية (تم الحصول عليها في الخطوة 3.3) إلى 2 مل من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على 900 ميكرولتر من محلول إعادة التعليق المثلج البارد (50 ملي مولار أحادي فوسفات الصوديوم ، 1 ملي مولار DTT ، 1 ملي EDTA ، و 5.9٪ سكروز ، درجة الحموضة 7.5) مكملة ب 0.5٪ BSA و 0.01٪ Tween-20 ، واخلطها لفترة وجيزة عن طريق سحب العينات.
6. جهاز طرد مركزي عند 18,000 × جم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإنتاج كريات تحتوي على "LDH المرسوب". شفط المادة الطافية جيدا (مع الشفط) لترك الكريات جافة قدر الإمكان. ضع العينات في فريزر -80 درجة مئوية.
7. انقل 150 ميكرولتر من كل محلول مخفف لتعطيل الخلية (تم الحصول عليه في الخطوة 3.3) إلى أنابيب جديدة ، ووضع العينات في فريزر -80 درجة مئوية. استخدم هذه العينات لتحديد مستويات "LDH الإجمالية" في الخلايا.
   ملاحظه: في هذه المرحلة ، يمكن إيقاف التجربة مؤقتا طالما رغبت في ذلك.

فئة

4. استخراج LDH وقياس النشاط الأنزيمي LDH

1. قم بإذابة عينات "LDH المترسب" (من الخطوة 3.6) و "LDH الإجمالي" (من الخطوة 3.7) على الجليد.
2. أضف 300 ميكرولتر من محلول إعادة التعليق المثلج البارد الذي يحتوي على 1.5٪ Triton X-405 إلى عينات "LDH الإجمالية" (مما ينتج عنه تركيز نهائي ل Triton X-405 بنسبة 1٪). قم بتدوير العينات على أسطوانة في غرفة باردة (4-8 درجات مئوية) لمدة 30 دقيقة.
3. أضف 750 ميكرولتر من محلول إعادة التعليق المثلج البارد مع 1٪ Triton X-405 إلى عينات "LDH المرسوبة" ، وأعد تعليق الكريات بماصة حتى يتم الوصول إلى محلول متجانس.
4. الطرد المركزي للعينات من الخطوتين 4.2 و 4.3 عند 18,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لترسيب الحطام الخلوي غير المذاب.
5. امزج 4 أجزاء من البارد 65 ملي مولار إيميدازول (درجة الحموضة 7.5) / 0.75 ملي مولار بيروفات مع جزء واحد من البارد 65 ملي مولار إيميدازول (الرقم الهيدروجيني 7.5) / 1.8 ملي مولار NADH للحصول على محلول عملي مستقر لمدة ثلاثة أسابيع على الأقل عند 4 درجات مئوية.
6. امزج 3-30 ميكرولتر من المواد الطافية من الخطوة 4.4 مع 200 ميكرولتر من محلول العمل الخطوة 4.5.
7. حدد كمية LDH عن طريق قياس النشاط الأنزيمي LDH كانخفاض في امتصاص نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (الشكل المختزل) (NADH) عند 340 نانومتر عند 37 درجة مئوية مقارنة بمعيار بتركيز LDH معروف. قم بإجراء قياسات الامتصاص حتى يقترب التفاعل من الاكتمال ، أي حتى لا يتغير الامتصاص عند 340 نانومتر بمرور الوقت. < / > ملاحظه: هذه هي الطريقة الكيميائية الحيوية الكلاسيكية لقياس نشاط LDH. على الرغم من أن البروتوكول الحالي يقوم بإجراء التفاعل عند 37 درجة مئوية ، إلا أنه يمكن إجراؤه أيضا في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) ، وهو أمر مستحسن عند إجراء قياس الطيف الضوئي اليدوي. يستخدم البروتوكول الحالي أداة آلية متعددة المحلل ، والتي تمزج العينات بطريقة آلية مع محلول العمل في لوحة 96 بئرا ، وتقيس الامتصاص عند 340 نانومتر عند 37 درجة مئوية كل 20 ثانية لمدة 3 دقائق. بعد ذلك ، يحسب برنامج الجهاز تركيز LDH ، معبرا عنه بالوحدات (U) / L ، من خلال مقارنة ميل قياسات الامتصاص بمرور الوقت مقارنة بالمنحنى القياسي الذي تم الحصول عليه من خلال المعايرة بمعيار تركيز LDH المعروف. النطاق الخطي للكشف من خلال هذا النهج هو 30-1,500 U / L. كبديل ، توجد مجموعة متنوعة من المجموعات المتاحة تجاريا لقياس LDH. يعتمد بعضها على اقتران التفاعل الأنزيمي بتوليد منتجات القياس اللوني أو الفلوري ، مما يتيح الكشف بوسائل أخرى غير القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية ، ومع نطاقات خطية أخرى للكشف.

المواد