اختبار لتقييم فعالية الدواء ضد نموذج عدوى المتفطرة السلية

الملخص

المصدر: Schaaf، K.، et al. اختبار متوافق عالي الإنتاجية لتقييم فعالية الدواء ضد المتفطرة السلية التي تمر عبر البلاعم. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو فحصا لتقييم فعالية الأدوية ضد عدوى المتفطرة السلية (Mtb). يتم إنشاء نموذج عدوى في المختبر يحتوي على مجاميع Mtb / البلاعم التي تحاكي العدوى في الجسم الحي. عند إدخال المضادات الحيوية المناسبة ، يتم اختبار فعاليتها عن طريق مقايسة ريسوزارين لمراقبة بقاء البكتيريا مع زيادة تركيزات الأدوية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. شروط زراعة البروتين الفلوري الأخضر الذي يعبر عن M. tuberculosis mc²6206 (Mtb-GFP)

ملاحظة: يتم استخدام سلالة أكسوتروف المشتق من M. tuberculosis H37Rv mc²6206 (ΔpanCD ، ΔleuCD) مع gfp (بروتين الفلورسنت الأخضر) الذي يعبر عن البلازميد pMN437 في جميع أنحاء هذا البروتوكول. من الممكن استبدال سلالة Mtb-GFP بسلالة غير gfp تعبر عن سلالة من النوع البري لتمكين الباحثين من الوصول بسهولة إلى السلالة. ومع ذلك ، فإن التعبير عن gfp مرغوب فيه لتمكين التأكيد البصري للبلعمة وتشكيل مجاميع Mtb / البلاعم. للتخزين طويل الأجل ، تم تجميد Mtb-GFP عند -80 درجة مئوية في وسائط كاملة 7H9 (موصوفة في الخطوة 1.1) مكملة بنسبة 20٪ من الجلسرين.

1. قم بإعداد وسائط Mtb-GFP كاملة (7H9-C) عن طريق استكمال وسط 7H9 بنسبة 10٪ Middlebrook OADC (Oleic Albumin Dextrose Catalase) ، 0.02٪ tyloxapol ، 24 ميكروغرام / مل D-pantothenic acid ، 50 ميكروغرام / مل L-leucine و 50 ميكروغرام / مل Hygromycin B.
2. قم بإذابة قارورة واحدة من Mtb-GFP وأضف 10 مل من 7H9-C في قارورة PETG ذات قاع مربع سعة 30 مل.
3. احتضان عند 37 درجة مئوية على شاكر دوار (50 دورة في الدقيقة). خذ قياسات الكثافة الضوئية (OD₆₀₀) كل بضعة أيام حتى يصل OD₆₀₀ إلى 1.0 (حوالي 5-8 أيام).
4. تمييع ومرور الثقافة حسب الحاجة للحفاظ على OD₆₀₀ بين 0.2-1.0.
5. للعدوى ، استخدم مزرعة ثابتة ل Mtb-GFP خلال مرحلة النمو اللوغاريتمي (OD₆₀₀ من 0.6-1). لتجنب الثقافات المتكتلة ، قم بصوتنة قارورة ثقافة Mtb في حمام مائي (130 واط ؛ 3 × 5 بقول ثانية) مرة أو مرتين في الأسبوع.

< p class = "jove_title" >2. شروط الثقافة لخلايا THP-1

1. قم بإعداد وسائط خلوية THP-1 كاملة (RPMI-C) عن طريق استكمال وسيط RPMI 1640 بمصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 10٪ ، و 2 ملي مولار L-glutamine ، و 10 ملي مولار HEPES (4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازين إيثان سلفونيك).
2. احتضان الخلايا في قارورة T-75 عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
3. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو قياس التدفق الخلوي كل يومين وحافظ على خلايا THP-1 بكثافة تتراوح بين 0.1 إلى 0.6 مليون لكل مل.

3. بروتوكول العدوى لإنشاء هياكل مجمعة Mtb / البلاعم

1. تحضير خلية THP-1 (لكل طبق 96 بئر)
   1. أجهزة الطرد المركزي 7 × 10⁶ خلايا THP-1 عند 250 × جم لمدة 5 دقائق.
2. تحضير Mtb-GFP
   1. جهاز طرد مركزي 2.8 × 10⁸ Mtb-GFP عند 3,200 × جم لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح باستخدام تحويل OD₆₀₀ 1.0 = 3 × 10⁸ بكتيريا/مل.
   2. يغسل مرة واحدة باستخدام RPMI-C وجهاز الطرد المركزي كما في الخطوة 3.2.1.
   3. أعد التعليق في 7 مل RPMI-C والدوامة لمدة 10 ثوان.
3. العدوى
   ملاحظة: انظر الشكل 1 للقالب.
   1. قم بإعداد صفيحة من 96 بئرا عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من الماء المعقم في الصفوف A و H والعمودين 1 و 12 لحافة الماء لمنع تبخر وسط الاستزراع.
   2. أضف 200 ميكرولتر RPMI-C إلى العمود 2 (B2 إلى G2) للتحكم في الخلفية (فارغ).
   3. للإصابة بالعدوى، أضف تعليق Mtb-GFP (الخطوة 3.2) إلى تعليق خلية THP-1 (الخطوة 3.1) واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات. كثافة خلايا THP-1 النهائية هي 5 × 10⁵ لكل مل وتعدد العدوى المقابل هو 40.
   4. صب تعليق THP-1 / Mtb-GFP في خزان سعة 25 مل.
   5. أضف 200 ميكرولتر من معلق THP-1/Mtb-GFP إلى جميع الآبار ال 96 المتبقية (من B3 إلى G11) باستخدام ماصة متعددة القنوات.
      ملاحظه: إذا كنت تعمل مع عدة ألواح مكونة من 96 بئرا ، فقم بتعليق تعليق THP-1 / Mtb المتبقي بانتظام في الخزان لضمان إضافة خليط متساو إلى كل بئر.
   6. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 7-10 أيام.
   7. قم بتغيير الوسائط كل يومين عن طريق إزالة 100 ميكرولتر من الوسائط المستهلكة ببطء من أعلى كل بئر وإضافة 100 ميكرولتر RPMI-C الدافئ مسبقا برفق باستخدام ماصة متعددة القنوات. لا تقم بتعليق الآبار وإزعاج مجاميع Mtb / البلاعم في قاع الآبار.
   8. افحص الآبار بصريا عن طريق المجهر الفلوري (هدف 4-10X) يوميا ، مع ملاحظة حجم مجاميع Mtb / البلاعم. بحلول اليوم 7-10 ، يجب أن تكون مجاميع Mtb / البلاعم كبيرة بما يكفي (راجع الشكل 2 كمرجع) للمضي قدما في اختبار فعالية الدواء (القسم 4).
   9. إذا رغبت في ذلك ، التقط صورا ل 96 بئرا باستخدام نظام تصوير خلوي آلي مزود بمجالات ساطعة ومجموعات مرشح GFP لتوثيق تكوين ركام Mtb / البلاعم><. ملاحظه: إذا لم يكن لدى المستخدمين إمكانية الوصول إلى نظام التصوير الآلي ، فيمكن التقاط صور للآبار التمثيلية باستخدام أي مجهر مناسب مع GFP وقدرات المجال الساطع.

فئة

4. مقايسة تثبيط النمو لتقييم فعالية الدواء ضد Mtb المشتقة من مجاميع Mtb / البلاعم

1. تحضير الدواء (شروط ثلاثية لدواءين)
   ملاحظة: انظر الشكل 1 أ للقالب.
   1. في صفيحة منفصلة مكونة من 96 بئرا ، أضف 125 ميكرولتر من وسائط 7H9-C إلى B2 إلى G10.
   2. قم بإعداد دواءين بضعف أعلى تركيز نهائي مطلوب في 1 مل من 7H9-C لحساب التخفيف في الخطوة 4.2.4.
   3. أضف 250 ميكرولتر من كل دواء إلى الآبار B11-C11-D11 و E11-F11-G11 ، على التوالي للعلاجات الثلاثية.
   4. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بتخفيف أدوية الاختبار بشكل متسلسل عن طريق تحريك 125 ميكرولتر من B11-G11 إلى B10-G10. امزج عن طريق سحب العينات 5 مرات في كل خطوة.
   5. استمر في تحريك 125 ميكرولتر من عمود إلى آخر (من اليمين إلى اليسار) عبر اللوحة ، وتوقف بعد العمود 4.
   6. بعد خلط العمود 4 ، تخلص من 125 ميكرولتر في حاوية نفايات. يجب ألا يحتوي العمودان 2 و 3 على أي أدوية للسماح باستخدامها كخلفية (فارغة) وضوابط النمو الإيجابية.
      ملاحظه: بدلا من ذلك ، اتبع النموذج الموجود في الشكل 1 ب لاختبار مكتبات الأدوية. يمكن أن تستوعب كل صفيحة مكونة من 96 بئرا 58 دواء بتركيز واحد. قم بإعداد صفيحة الدواء هذه باستخدام ضعف التركيز النهائي المطلوب حيث سيتم تخفيفها إلى النصف في الخطوة 4.2.4.
2. العلاج من تعاطي المخدرات:
   1. استرجع اللوحة المكونة من 96 بئرا التي تحتوي على البلاعم المصابة ب Mtb (مجاميع Mtb / البلاعم).
   2. صب جميع الآبار ذات الصلة بعناية (B2 إلى G11) باستخدام ماصة متعددة القنوات. قم بذلك بطريقة من خطوتين: أولا ، قم بإزالة 150 ميكرولتر دون إمالة اللوحة ، ثم قم بإزالة الوسائط المتبقية (~ 50 ميكرولتر) عن طريق إمالة اللوحة وإدخال طرف الماصة في الحافة السفلية للبئر. نظرا لأن مجاميع Mtb / البلاعم ملتصقة بقاع البئر ، فلا ينبغي فقد أي مواد.
   3. أضف برفق 100 ميكرولتر من وسائط 7H9-C إلى جميع الآبار ذات الصلة (B2 إلى G11) من اللوحة التي تحتوي على مجاميع Mtb / البلاعم.
   4. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، انقل 100 ميكرولتر من الصفيحة المكونة من 96 بئرا المحتوية على الدواء (الخطوة 4.1) إلى الآبار المقابلة للوحة العدوى.
   5. ضعها في كيس محكم الغلق واحتضنها لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >5. القياس الكمي لفعالية الدواء باستخدام مقايسة ريزازورين ميكروتيتر

1. تحضير محلول مخزون الريزازورين بتركيز نهائي قدره 0.8 مجم / مل في H₂O. قم بالتصفية من خلال غشاء فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) بحجم المسام 0.22 ميكرومتر للتعقيم.
2. قم بإعداد محلول عمل الريزازورين عن طريق خلط محلول مخزون الريزازورين ، H₂O ، و Tween-80 (محلول 20٪ في H₂O) بنسبة 2: 1: 1. التركيزات النهائية هي 0.4 مجم / مل ريزازورين و 5٪ توين -80.
3. باستخدام قارئ الألواح ، قم بإعداد برنامج لقراءة التألق عند إثارة 530 نانومتر وانبعاث 590 نانومتر كل 30 دقيقة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
4. أضف 20 ميكرولتر من محلول عمل الريزازورين إلى جميع الآبار ذات الصلة (B2 إلى G11) من الصفيحة المعالجة بالأدوية (الخطوة 4.11) باستخدام ماصة متعددة القنوات.
5. ضع اللوحة على قارئ اللوحة وابدأ البرنامج الذي تم إعداده في الخطوة 5.3.
   ملاحظه: لتسهيل معالجة كميات كبيرة من لوحات الفحص ، يكفي تطوير الاختبار في حاضنة 37 درجة مئوية وإجراء قراءات مضان واحدة كل 24 ساعة. ينطبق هذا أيضا على المستخدمين الذين ليس لديهم إمكانية الوصول إلى قارئ الألواح بقدرات حركية وحضانة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تخطيط لوحة الدواء. (أ) نموذج مثال للوحة تحدي المخدرات المستخدمة في الخطوة 4. وهذا يسمح بالاختبار المتوازي لعقارين في آبار ثلاثية النسخ بتركيزات 8 تركيزات محددة. كتجربة تمثيلية ، استخدمنا ريفامبيسين (RIF) وموكسي فلوكساسين (MOXI) بدءا من 2 ميكرومتر و 2.5 ميكرومتر ، على التوالي. (ب) ويقدم أيضا نموذج بديل لفحص الإنتاجية لإظهار إمكانية اختبار 58 مركبا ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 7H9 بي دي ديفكو هاتف: 271310 اتبع توصيات الشركة المصنعة ميدلبروك OADC BD Biosciences 212351 تايلوكسابول سيغما تي 8761 تحضير محلول مخزون 20٪ في H₂O ؛ تعقيم المرشح د- ملح حمض البانتوثنيك هيميكالسيوم سيغما ص 5710 تحضير محلول مخزون 24 مجم / مل في H₂O ؛ تعقيم المرشح L-leucine MP الطب الحيوي 194694 تحضير محلول مخزون 50 مجم / مل في H₂O ؛ تعقيم المرشح هيغروميسين ب EMD ميليبور 400051 تحضير محلول مخزون 200 مجم / مل في H₂O زجاجة وسائط Nalgene Square PETG ثيرمو فيشر 2019-0030 وسائط RPMI 1640 هيكلون SH30027.01 مصل الأبقار الجنينية أتلانتا بيولوجيكس S12450H ل-جلوتامين كورنينج MT25005CI هيبس هيكلون SH30237.01 قارئ لوحة Cytation 3 بيوتيك قابلة للتبديل مع أي قارئ لوحة فلورية ومجهر برنامج Gen5 بيوتيك تسجيل وتحليل انتقال الريزاسورين ريفامبيسين فيشر ساينتيك BP2679250 تحضير محلول مرق 10 مجم / مل في H₂O موكسيفلوكساسين هيدروكلوريد أكروس أورجانكس 457960010 تحضير محلول مرق 10 مجم / مل في H₂O ريزازورين ملح الصوديوم سيغما R7017 تحضير محلول مخزون 800 ميكروغرام / مل في H₂O ؛ تعقيم المرشح توين 80 فيشر ساينتيك T164500 تحضير محلول مخزون 20٪ في H₂O ؛ تعقيم المرشح