اختبار في المختبر لفحص تعزيز العدوى الفيروسية المعتمد على الأجسام المضادة

الملخص

المصدر: Valiant، W. G.، et al. اختبار بسيط قائم على قياس التدفق الخلوي لتحديد التعزيز المعتمد على الأجسام المضادة في المختبر لفيروس حمى الضنك باستخدام مصل النقاهة لفيروس زيكا. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو فحصا لقياس التعزيز المعتمد على الأجسام المضادة (ADE) لعدوى فيروس حمى الضنك باستخدام مصل النقاهة لفيروس زيكا. يستخدم الاختبار الجسيمات الفيروسية لمراسل حمى الضنك (RVPs) التي تشفر بروتين فلوري أخضر. تتفاعل الأجسام المضادة في المصل ضد فيروس زيكا مع RVPs لتشكيل معقد. تعزز الأجسام المضادة المرتبطة امتصاص RVP بواسطة الخلايا التي تعبر عن مستقبل Fc ، والذي يتم اكتشافه باستخدام قياس التدفق الخلوي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

1. اليوم 1

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات الموضحة أدناه في خزانة السلامة الحيوية ذات التدفق الصفحي المعقمة المستخدمة لزراعة الأنسجة في مختبر BSL-2.

1. قم بإذابة عينات المصل في درجة حرارة الغرفة ونقل 100 ميكرولتر من كل عينة مصل إلى أنبوب معقم. قم بتعطيل الحرارة لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية إما في حمام مائي أو خلاط حراري قابل لضبط درجة الحرارة. قم بعمل تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف لعينة المصل تتراوح من 1: 1 إلى 1: 1,000 باستخدام RPMI-10 البارد (RPMI مع مصل بقري جنيني بنسبة 10٪).
2. انقل 10 ميكرولتر من عينة المصل المخففة بشكل متسلسل إلى كل بئر من صفيحة معقمة ذات قاع V سعة 96 بئرا. قم بتضمين مجموعتين من آبار التحكم ، RPMI-10 مع RVPs فقط وبدون عينة مصل ، و RPMI-10 فقط بدون RVPs وبدون عينة مصل. قم بإعداد كل عينة مصل وعناصر تحكم RPMI-10 في ثلاث نسخ.
3. قم بإزالة حمى الضنك 1 و 2 و 3 و 4 RVPs من الفريزر -80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج في حمام مائي 37 درجة مئوية. انقل RVPs المذابة على الفور إلى الجليد. الحصول على ما يقرب من 170 ميكرولتر من RVPs لكل عينة مصل (10 ميكرولتر من RVPs × 3 آبار لكل تخفيف مصل (1: 1 ، 1: 10 ، 1: 100 ، 1: 1،000) و 10 ميكرولتر من RVPs × 3 آبار لكل من RPMI-10 مع RVP فقط في الآبار).
4. ماصة 10 ميكرولتر من RVPs في كل بئر من الصفيحة السفلية على شكل V المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على عينة المصل وإلى RPMI-10 مع آبار التحكم RVPs (بدون مصل). لا تقم بإضافة RVPs إلى آبار RPMI-10 فقط (بدون عينة مصل ولا RVP). تخلط جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 5-10 مرات. أضف 10 ميكرولتر RPMI-10 بارد بدلا من RVPs إلى كل آبار تحكم RPMI-10 باردة فقط (بدون عينة مصل ولا RVP).
5. انقل اللوحة ذات القاع على شكل حرف V المكونة من 96 بئرا إلى حاضنة واحتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. أثناء احتضان اللوحة السفلية على شكل V التي تبلغ 96 بئرا ، قم بتنظيف سطح خزانة السلامة الحيوية بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
6. قم بإزالة قارورة T75 ملتصقة بالكامل من خلايا K562 من الحاضنة ، واخلط الخلايا جيدا باستخدام ماصة معقمة سعة 5 مل ، وانقل 5 مل من الخلايا إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل.
   ملاحظه: يتم الاحتفاظ بخلايا K562 في RPMI-10 ويتم زراعتها الفرعية عند 1 × 10⁶ / مل.
7. احسب عدد الخلايا عن طريق إزالة 10 ميكرولتر من الخلايا من الأنبوب المخروطي المعقم سعة 15 مل واخلطه مع 10 ميكرولتر من أزرق التريفان. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم لتحديد العدد الإجمالي للخلايا في الأنبوب المخروطي سعة 15 مل.
8. الطرد المركزي 15 مل مخروطي الشكل مع خلايا عند ~ 1,200 × جم لمدة 10 دقائق ، وصب المادة الطافية ، وإعادة تعليق الخلايا في RPMI-10 الدافئ بتركيز 80,000 خلية / 30 ميكرولتر من الوسائط (2.66 × 10⁶ خلايا / مل).
9. قم بإزالة اللوحة ذات القاع V سعة 96 بئرا من الحاضنة (الخطوة 1.6) ، وانقل 30 ميكرولتر من خلايا K562 إلى كل بئر من اللوحة السفلية على شكل V المكونة من 96 بئرا ، واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 5-10 مرات. انقل اللوحة ذات القاع V المكونة من 96 بئرا إلى حاضنة واحتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO₂.
10. بعد الحضانة لمدة 1 ساعة ، قم بإزالة اللوحة ذات القاع V المكونة من 96 بئرا من الحاضنة وجهاز الطرد المركزي عند ~ 1,200 × جم لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بصب الوسائط من الآبار عن طريق قلب اللوحة رأسا على عقب إلى حاوية تحتوي على 10٪ مبيض.
11. اغسل الخلايا في كل بئر عن طريق إعادة تعليقها في 125 ميكرولتر من RPMI-10 الدافئ ، واخلطها جيدا باستخدام ماصة ، وقم بطرد اللوحة عند ~ 1,200 × جم لمدة 5 دقائق. كرر خطوة الغسيل هذه مرتين.
12. بعد الغسيل ، أضف 100 ميكرولتر من RPMI-10 الدافئ إلى كل بئر ، واخلطه لأعلى ولأسفل مع الماصة ، واحتضن اللوحة لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

< ص الفئة = "jove_title" >2. اليوم 3

1. قم بإزالة اللوحة ذات القاع على شكل V سعة 96 بئرا والتي تحتوي على 100 ميكرولتر من الخلايا والوسائط / البئر من الحاضنة وانقلها إلى خزانة السلامة الحيوية. باستخدام ماصة متعددة القنوات، امزج محتويات كل بئر وانقل الخلايا والوسائط إلى صفيحة قاع على شكل حرف U سعة 96 بئرا أو أنابيب بولي بروبيلين سعة 5 مل مسبقة التصنيف.
2. اشطف كل بئر في اللوحة السفلية على شكل حرف V المكونة من 96 بئرا ب 100 ميكرولتر من 1٪ بارافورمالدهيد (PFA) في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وانقله إلى الآبار المعنية في اللوحة السفلية المكونة من 96 بئرا أو أنابيب البولي بروبيلين ذات السعة 5 مل من الخطوة 2.1 للحصول على تركيز نهائي قدره 0.5٪ PFA / بئر أو أنبوب. امزج جيدا باستخدام ماصة متعددة القنوات ، وقم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم ، واتركها في الحاضنة لمدة 30 دقيقة لإصلاح الخلايا.
3. قم بإعداد مقياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد على سبيل المثال) عن طريق تشغيل خلايا K562 غير الملوثة لمعايرة التشتت الجانبي والأمامي جنبا إلى جنب مع إعدادات التألق. قناة التألق الوحيدة المطلوبة هي FL1 ، حيث أن GFP هو التألق الوحيد المنبعث من الخلايا. احصل على ~ 30,000-50,000 خلية من كل عينة.
   ملاحظه: يمكن استخدام أي مقياس تدفق خلوي قادر على قراءة مضان واحد للحصول على البيانات ، حيث أن الخلايا المصابة ب RVPs لن تنبعث منها سوى مضان أخضر بسبب وجود GFP ، ولا توجد حاجة إلى قنوات مضان أخرى.

< p class = "jove_title" >3. تحليل البيانات

1. قم بتحليل البيانات التي تم الحصول عليها على مقياس التدفق الخلوي باستخدام أي برنامج لتحليل قياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد).
   1. قم بتعيين البوابة الأولى بناء على FSC-A (منطقة التشتت الأمامي) مقابل FSC-H (التشتت الأمامي - الارتفاع) لتضمين الخلايا المفردة واستبعاد مزدوجات الفلورسنت التلقائية من التحليل. بعد ذلك ، قم بتوصيل الخلايا ذات البوابات المفردة بناء على SSC-A (منطقة التشتت الجانبي) مقابل FSC-A لاستبعاد أي حطام ذاتي الفلورسنت.
   2. تحليل الخلايا المسورة SSC-A مقابل FSC-A للتعبير عن GFP استنادا إلى SSC-A مقابل GFP-A. حدد النسبة المئوية لخلايا GFP + لكل تخفيف من المصل وعينات التحكم عن طريق وضع بوابة حول خلايا GFP +.
2. تحديد متوسط النسبة المئوية لخلايا GFP + لكل تخفيف عينة مصل وآبار تحكم بقسمة النسبة المئوية الإجمالية لخلايا GFP + في الآبار الثلاثية على 3.
3. احسب تعزيز الطية للعدوى بقسمة متوسط النسبة المئوية لخلايا GFP + في عينات المصل لكل تخفيف على متوسط النسبة المئوية لخلايا GFP + في RPMI-10 مع آبار التحكم RVPs (بدون عينة مصل).
4. تحسين طي الرسم البياني (المحور y) مقابل التخفيف (المحور x) ، وإجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA متبوعا باختبار Tukey اللاحق للمقارنات المتعددة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DENV 1-4 RVP جزيئي متكامل RVP-501 خلايا K562 ATCC سي سي إل -243 RPMI كورنينج 10-040-السيرة الذاتية FBS GE lifesceinces ش 30910.03 10٪ FBS في RPMI-10 البنسلين - ستربتومايسين MP الطب الحيوي 1670049 100 وحدة دولية قلم / مل ، 100 ميكروغرام Strep / مل في RPMI-10 هيبس سيليجرو 25-060-سنتيلتر 0.025 م في RPMI-10 محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100×) سيغما M7145 1x في RPMI-10 بيروفات الصوديوم سيليجرو 25-000-سنتيلتر 1 ملي متر في RPMI-10 ل-جلوتامين فيشر ساينتيك MT25005CI لوحات معقمة على شكل حرف V توماس العلمية 333-8001-01 فولت بي دي فالكون بولي بروبيلين 5 مل أنابيب FACS VWR 60819-728 لوحات U-bottom غير معقمة صقر الرقم المرجعي 353910 بديل عالي الإنتاجية لأنابيب FACS 5 مل ، ماصة معقمة مصلية دينفيل ص 7127 200uL أطراف ماصة معقمة دينفيل P3020 CPS أطراف ماصة معقمة 20 ميكرولتر دينفيل ص 1121 ماصة متعددة القنوات 50-200uL دينفيل P3975-8-B ماصة متعددة القنوات 5-50uL دينفيل P3975-9-B 20٪ فورماديهايد توسيميس #1008B حمام مائي ثيرموفيشر TSCOL35 خلاط حراري إيبندورف 2231000387 بديل للحمام المائي لتعطيل الحرارة حاضنة CO2 ثيرموفيشر 13-998-213 ايثانول سيجما ألدريتش E7023 التبييض السائل فيشر ساينتيك NC9724348 فلوجو 9.8 شركة تريستار برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي BD FACSDiva 6.1.2 بيكتون ديكنسون مقياس التدفق الخلوي BD LSR II بيكتون ديكنسون التبييض السائل فيشر ساينتيك NC9724348