فحص لفحص الجسيمات النانوية النشطة بيولوجيا لتثبيط إشارات المستقبلات الشبيهة بالحصيلة

الملخص

المصدر: Yang, H., et al. فحص الجسيمات النانوية النشطة بيولوجيا في الخلايا المناعية البلعمية بحثا عن مثبطات إشارات المستقبلات الشبيهة بالحصان. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو فحصا قائما على خلية المراسل لفحص الجسيمات النانوية النشطة بيولوجيا المحتملة التي تمنع إشارات المستقبلات الشبيهة بالحصيلة (TLR). يتضمن الاختبار إدخال عديدات السكاريد الدهنية (LPS) الممزوجة بالجسيمات النانوية الهجينة بالبتيد والذهب إلى البلاعم المراسلة التي تعبر عن بروتينات المراسل - الفوسفاتيز القلوي الجنيني المفرز (SEAP) ولوسيفيراز. يتم تحديد تقليل إشارة TLR التي يسببها LPS بوساطة الهجينة عن طريق قياس إشارات المراسل.

البروتوكول

1. فحص مثبطات النانو TLR4 المحتملة باستخدام خلايا المراسل

ملاحظة: نظرا لأن إشارات TLR4 تستخدم كلا من المسارات المعتمدة على TRIF الأرضية المعتمدة على MyD88 ، فقد تم تحديدها كهدف أساسي لتشمل مجموعة واسعة من مسارات إشارات TLR. تستخدم خلايا مراسل THP-1-XBlue لفحص تنشيط NF-κB / AP-1 بشكل أساسي بينما خلايا THP-1-Dual مخصصة لتنشيط IRF من نقل الإشارة المعتمد على TRIF.

1. تحديد جرعة LPS المثلى عن طريق إنشاء منحنى استجابة الجرعة قبل الفحص.
   1. قم بتخفيف محلول LPS العامل إلى تركيز نهائي من 0.01 - 100 نانوغرام / مل في وسط R10 (قم بالتخفيف بمقياس log10). قم بتخطيط تصميم اللوحة وقم بالتخفيف في لوحة ثقافة مستديرة القاع ذات 96 بئرا. تأكد من أن كل بئر يحتوي على 110 ميكرولتر من المحلول بعد التخفيف.
   2. قم بإزالة وسط الثقافة برفق من اللوحة المصنفة بالخلايا باستخدام شفاط فراغ.
   3. نقل LPS المحتوي على وسيط R10 المحضر في لوحة التخفيف (1.1.1) إلى لوحة الاستزراع وفقا لتخطيط العينات. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية (في حاضنة زراعة الخلايا) لمدة 24 ساعة.
   4. في 24 ساعة ، انقل المواد الطافية بعناية (80 ميكرولتر / بئر) إلى صفيحة جديدة ذات قاع دائري 96 بئرا. قم بإجراء مقايسة التلألؤ اللوني و / أو اللوسيفيراز على هذه المحاليل على الفور أو قم بتخزينها عند 4 درجات مئوية (عدة ساعات) أو -20 درجة مئوية (أيام) قبل تطوير المقايسة.
      ملاحظه: يجب أن يكون تصميم تخطيط اللوحة بسيطا وواضحا للتجربة وتحليل البيانات. لكل شرط ، يجب مراعاة 2-4 تكرارات. قم دائما بتضمين مجموعة تحكم سلبية (LPS null). يوصى باستخدام خلايا THP-1-XBlue لتنشيط NF-κB / AP-1 لأن الخلايا المزدوجة لها خلفية عالية نسبيا من تنشيط NF-κB / AP-1 بعد تمايزها إلى ضامة. ومع ذلك ، من الممكن استخدام الخلايا المزدوجة للإبلاغ عن كل من NF-κB / AP-1 وتنشيط IRF.
2. تطوير الاختبار اللوني لتنشيط NF-κB / AP-1 ومقايسة تلألؤ لوسيفيراز لتنشيط IRF.
   1. لتقييم تنشيط NF-κB / AP-1 ، قم بنقل 20 ميكرولتر من المادة الطافية لكل عينة إلى صفيحة ثقافة مسطحة القاع الجديدة المكونة من 96 بئرا ، وأضف 180 ميكرولتر من محلول الركيزة SEAP الدافئ مسبقا في كل بئر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة للسماح بتطور اللون (الوردي إلى الأزرق الداكن). اجمع الامتصاص عند 655 نانومتر على قارئ لوحة.
      أنذر: يمكن أن يختلف وقت الحضانة بناء على تطور اللون (30 دقيقة حتى الحضانة بين عشية وضحاها). يوصى بالانتظار حتى تصل الكثافة البصرية (OD) للون الأغمق إلى أعلى من 1 مع تجنب تشبع تطور اللون (OD >3).
   2. لتحليل تنشيط IRF ، انقل 10 ميكرولتر من المادة الطافية لكل عينة إلى صفيحة بيضاء مسطحة القاع ذات 96 بئرا. أضف محلول لوسيفيراز (50 ميكرولتر) واجمع اللمعان جيدا على الفور.
      ملاحظه: يوصى بشدة باستخدام قارئ لوحة التلألؤ مع وظيفة الحقن التلقائي لضمان الاتساق في قراءة التلألؤ من البئر إلى البئر ومن لوحة إلى أخرى. إذا تم حقن محاليل الركيزة يدويا ، فيرجى التأكد من وقت حضانة ثابت وإعداد قراءة لكل بئر.
3. قم بإجراء فحص الفحص على أنواع مختلفة من الببتيد-GNP الهجينة مع تحفيز LPS 10 نانوغرام / مل (بناء على 1.1). اتبع نفس الإجراء في 1.2 لتطوير مقايسة المراسل.
   1. تركيز الهجينة الببتيد-GNP إلى 200 نانومتر في وسط R10 باستخدام طريقة الطرد المركزي. جهاز الطرد المركزي 20 حجما من المحلول الهجين (10 نانومتر) عند 18,000 × جم لمدة 30 دقيقة ، وتخلص بعناية من المواد الطافية اجمع الهجينة (في الجزء السفلي من الأنبوب) في أنبوب ، واغسلها باستخدام PBS مرتين ، وأعد تعليق الهجينة في حجم واحد من وسط R10.
   2. امزج كميات متساوية من الهجينة المركزة و LPS (20 نانوغرام / مل) المحتوي على وسط R10 ليكون التركيز النهائي للهجينة و LPS 100 نانومتر و 10 نانوغرام / مل ، على التوالي.
   3. قم بإزالة وسط الاستزراع من اللوحة المستزرعة وأضف 100 ميكرولتر من المحلول المختلط إلى كل بئر (3 مكررات لكل حالة) ؛ قم بتضمين عنصر تحكم سلبي (متوسط فقط) وتحكم LPS (10 نانوغرام / مل LPS بدون هجينة).
   4. بعد 24 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، انقل وسط كل بئر إلى أنبوب وقم بالطرد المركزي للأنابيب عند 18,000 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. اجمع المواد الطافية (50-80 ميكرولتر / أنبوب) في صفيحة دائرية القاع 96 بئرا ، وقم بإجراء فحص المراسل كما هو موضح في 3.2.
      أنذر: عند التخلص من المواد الطافية بعد الطرد المركزي ، لا تقم بتحريك الهجينة في الجزء السفلي من الأنبوب.
      ملاحظه: يعد الطرد المركزي في الخطوة 1.3.4 مهما جدا لإزالة الجسيمات النانوية الهجينة غير الداخلية من وسط الاستزراع ، ويمكن أن تتجنب تداخل الهجينة مع قراءات اللونية / اللمعان. وذلك لأن الجسيمات النانوية الذهبية يمكن أن تمتص أطوال موجية واسعة من الضوء اعتمادا على حجمها وتكتلها.

2. التحقق من التأثير المثبط للمرشحين المحتملين

ملاحظة: لتأكيد التأثير المثبط للمرشحين المحتملين من الفحص ، يتم استخدام نهجين. أحدهما هو فحص استجابات جرعة المنشطات (LPS) بتركيز هجين ثابت (أو العكس) ؛ والآخر هو النظر مباشرة إلى تثبيط إشارات NF-κB / AP-1 و IRF3 عبر النشاف المناعي.

1. في النهج الأول ، قم بإجراء مقايسة المراسل مع 100 نانومتر من هجينة الرصاص وتركيزين LPS عند 1 نانوغرام / مل و 10 نانوغرام / مل باتباع نفس الإجراءات الموضحة في 1.3. قم بتضمين هجين غير نشط (بناء على نتائج الفحص) كعنصر تحكم هجين للمقارنة.
2. بالنسبة لنهج النشاف المناعي ، يرجى اتباع الإجراءات التجريبية القياسية.
   1. استزراع خلايا THP-1 في وسط R10 ، وزرع الخلايا في صفيحة مزرعة مكونة من 12 بئرا (2 × 10⁶ خلايا / بئر) ، وقم بتمييزها إلى ضامة عن طريق معالجة الخلايا ب 50 نانوغرام / مل PMA لمدة 24 ساعة متبوعة بالراحة لمدة يومين.
   2. بعد تمايز الخلايا ، قم بتحفيز الخلايا ب 10 نانوغرام / مل LPS مع / بدون الهجينة (100 نانومتر) بمرور الوقت (حتى 4 ساعات). في نقاط زمنية مختلفة (0 و 5 و 15 و 30 و 60 و 120 و 240 دقيقة) ، قم بإعداد محللات الخلية للنشاف المناعي. قم بتضمين هجين غير نشط كعنصر تحكم.
   3. استكشاف إشارات IκBα و p65 الفسفوري و IRF3 الفسفوري لفحص التأثير المثبط للهجينة الرصاصية على تنشيط NF-κB و IRF3. تحقق من إشارات β-actin وإجمالي IRF3 كعناصر تحكم داخلية.
      ملاحظه: غالبا ما يحدث نقل الإشارة بشكل أسرع بكثير (في غضون ساعات قليلة) من التعبير عن إنزيمات المراسل SEAP و luciferase (24 ساعة). يوصى بشدة أيضا بإجراء فحص الجدوى للأنواع الهجينة المختبرة في 24 ساعة كطريقة أخرى للتحقق من الصحة.

3. تقييم خصوصية TLR

ملاحظة: للتحقيق في خصوصية TLR للهجين الببتيد الرصاصي و GNP ، يتم اختبار مسارات إشارات TLR الأخرى ، بما في ذلك TLR2 و TLR3 و TLR5. يتم استبعاد TLR7 و 8 و 9 لأن الضامة المشتقة من THP-1 لا تستجيب بشكل جيد لتحفيز TLRs هذه بسبب عدم وجود تعبير TLR7 و 8 و 9 في الضامة.

1. اختبر تركيزات مختلفة (1 نانوغرام / مل إلى 25 ميكروغرام / مل) من الروابط الخاصة ب TLR2 (Pam3CSK4) و TLR3 (poly I: C) و TLR5 (الأسواط) على كل من البلاعم المشتقة من خلايا المراسل للحصول على التركيز الأمثل باتباع نفس الإجراء في 1.1 و 1.2.
2. عالج الخلايا بمخاليط هجين الرصاص (100 نانومتر) وكل رابط TLR بالتركيز الذي تم الحصول عليه من 3.1 لتقييم الخصوصية المثبطة لهجين الرصاص وفقا للإجراء التجريبي الموضح في 1.3. قم بتضمين الهجين غير النشط كعنصر تحكم للمقارنة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خلية مراسل THP-1-XBlue إنفيفوجين THPX-SP حافظ على مرور زراعة الخلايا أقل من 20 THP-1-خلية ريبوتر مزدوجة إنفيفوجين THPD-NFIS حافظ على مرور زراعة الخلايا أقل من 20 RPMI-1640 (خال من L-glutamine) جنرال إلكتريك للرعاية الصحية SH30096.02 قم بتسخين درجة حرارة تصل إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام ؛ أضف المكملات الغذائية لعمل متوسط كامل R10 مصل الأبقار الجنينية (مؤهل) ثيرمو فيشر العلمي 12484028 تعطيل الحرارة ؛ 10٪ في RPMI-1640 ل-جلوتامين ثيرمو فيشر العلمي SH30034.02 2 ملي مولار في الوسط الكامل R10 بيروفات الصوديوم ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 11360-070 1 ملي مولار في الوسط الكامل R10 محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco ، 1X ، بدون كالسيوم ، مغنيسيوم جنرال إلكتريك للرعاية الصحية SH30028.02 استخدم لغسل الخلايا وإعداد الكاشف كوانتي بلو إنفيفوجين مندوب QB1 الركيزة SEAP كوانتي لوك إنفيفوجين مندوب QLC2 ركيزة لوسيفيراز زيوسين إنفيفوجين النمل الزنك -1 اختيار المضادات الحيوية لخلايا المراسل بلاستيسيدين إنفيفوجين مضاد ل BL-1 اختيار المضادات الحيوية لخلايا المراسل ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) للبيولوجيا الجزيئية سيغمال ألدريتش D8418-100 مل استخدم لتحضير الكاشف عديد السكاريد الدهني (LPS) من بكتريا قولونية K12 إنفيفوجين TLRL-EKLPS ترابط TLR4 فلاجيلين من S. Typhimurium (FLA-ST) ، فائق النقاء إنفيفوجين TLRL-EPSTFLA TLR5 ligand قارئ الألواح الدقيقة SpectraMax Plus 384 الأجهزة الجزيئية غير متاح قراءة الفحص اللوني قارئ الألواح الدقيقة متعدد الأوضاع Infinite M200 Pro مع حاقنات تيكان غير متاح قراءة luminiscience لوحة فحص كوستار ، 96 بئر بيضاء مع قاع مسطح شفاف ، معالجة الأنسجة كورنينج كوستار 3903 تستخدم لفحص الإنارة