اختبار تشكيل التركيز لقياس عيار الفيروس في أعضاء الفأر المصاب

الملخص

المصدر: Brien، J. D. et al.، عزل وقياس فيروس زيكا من أعضاء متعددة في الفأر. J. Vis. Exp.(2019)

يوضح الفيديو إجراء لقياس فيروس زيكا في أعضاء الفئران المتعددة عبر مقايسة تشكيل التركيز. تتضمن العملية إصابة الطبقات الأحادية لخلايا الثدييات بتجانسات الأنسجة المصابة بالفيروسات ، متبوعة باستخدام ميثيل السليلوز لمنع انتشار الفيروس. بعد ذلك ، يتم استخدام التلوين المناعي لتمكين القياس الكمي الدقيق وقياس العدوى الخاصة بالأعضاء.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. عزل الأعضاء

ملاحظة: الفيروس غير مستقر في درجة حرارة الغرفة (RT) ، لذلك يجب تخطيط عدد التي يتم حصادها في وقت واحد بعناية للحفاظ على العيارات الفيروسية.

1. إصابة الفئران باستخدام الجرعة والمسار المختارين ، بناء على النمط الظاهري المطلوب. بالنسبة لهذا البروتوكول ، قم بإصابة الفئران من الذكور والإناث من النوع الأول (Ifnar1^-/-) C57BL / 6 الذين يعانون من نقص مستقبلات الإنترفيرون من الذكور والإناث الذين تتراوح أعمارهم بين 8 إلى 10 أسابيع.
   1. تخدير الفئران Ifnar1 ^{- /-} بمزيج من الكيتامين (90 مجم / كجم) والزيلازين (10 مجم / كجم). اختبر منعكس الدواسة عن طريق قرصة إصبع القدم الصلبة لتأكيد التخدير. قم بإدارة 1 × 10⁵ وحدات تشكيل التركيز (FFU) من ZIKV في 50 ميكرولتر تحت الجلد (SC) عبر وسادة القدم.
2. تحضير جميع المواد اللازمة للحصاد في اليوم السابق لمقص 2 ، ملقط ، و 20 مل من 70٪ إيثانول (EtOH) في مخروطي 50 مل لتطهير الأدوات.
   1. تحضير المحاقن والإبر: حقنة سعة 20 مل للتروية ، وإبر 23 جم (حوالي 1 لكل قفص) ، وحقنة 1 مل مع إبر 25 جم (1 لكل 3-5 فئران). قبل وزن الأنابيب، أضف حبات فولاذية (في غطاء المحرك) إلى أنابيب غطاء لولبية ذات حلقة O سعة 1.5 مل (واحدة لكل عضو). يجب أن تكون الأنابيب مناسبة للتجانس.
3. جهز يوم الحصاد المواد اللازمة للتروية وتجميد الأعضاء.
   1. املأ دلو الثلج بالثلج الجاف و 70٪ EtOH لعمل حمام جليدي. تحضير محلول ملحي معقم بمخزن الفوسفات (PBS) بافتراض أن هناك حاجة إلى 25-30 مل لكل فأر من PBS لكل تروية 5-10 مل للحبل الشوكي). احصل على التخدير ، وهو مزيج من الكيتامين والزيلازين ، وافترض 300 ميكرولتر لكل فأر. ضع جميع المواد وأي أنابيب إضافية مطلوبة لقياس التدفق الخلوي ، وما إلى ذلك ، في حاوية ثانوية لنقلها إلى منشأة.
4. اتبع جميع الإجراءات اللازمة للدخول بما في ذلك ارتداء وخلع معدات الحماية الشخصية أثناء الدخول والخروج إلى منشأة.
   أنذر: يجب تنفيذ جميع الإجراءات في خزانة معتمدة للسلامة البيولوجية داخل منشأة مختبر السلامة البيولوجية من المستوى 2 (BSL-2).
5. إدارة التخدير ، 200-500 ميكرولتر ، داخل الصفاق اعتمادا على حجم ووزن. إذا كنت تعمل بمفردك ، فقم بإعطاء التخدير لحيوان واحد في كل مرة لتجنب قتل قبل حصاد الأعضاء.
   1. تأكد من جرعة التخدير عن طريق الضغط على إصبع القدم بالملقط لتقييم منعكس الدواسة. لا تستمر إلا إذا لم تستجيب تماما. استخدم المسامير لتثبيت الماوس على لوح الشمع. في هذه المرحلة ، غمر الفأر في 70٪ من الإيثانول لتجنب تلوث الشعر في إجراء حصاد الأعضاء.
6. النزيف النهائي عن طريق ثقب القلب.
   1. باستخدام المقص والملقط ، افتح من خلال تجويف الصدر لكشف القلب. جمع الدم عن طريق ثقب القلب (~ 800 ميكرولتر) ، ويمكن استخدام هذا في فحوصات متعددة بما في ذلك الكيمياء السريرية ، وأمراض الدم ، وقياس التدفق الخلوي للكشف عن الاستجابات الخاصة بالمستضد ، و PCR الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR) لتحليل رقم النسخة الفيروسية.
   2. لتحليل الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة qRT-PCR ، اجمع الدم في أنبوب EDTA في حالة الاستخراج من الدم الكامل أو في أنبوب الطرد المركزي الدقيق في حالة الاستخراج من المصل. (بالنسبة للمصل ، قم بتدوير الأنبوب بأقصى سرعة في جهاز طرد مركزي ، درجة حرارة الغرفة ، لمدة 20 دقيقة ، ثم قم بإزالة المصل إلى أنبوب منفصل). أضف بولي أكريلاميد خطي كحامل إلى عينة المصل بعد الانتهاء. يمكن بعد ذلك تحليل الحمض النووي الريبي أو تخزينه عند -80 درجة مئوية لمزيد من المعالجة في وقت لاحق.
7. املأ المحقنة سعة 20 مل ب PBS ، في درجة حرارة الغرفة (أو 37 درجة مئوية) ، وقم بفجر الفئران عن طريق إدخال إبرة الفراشة في البطين الأيسر. ثقب الأذين الأيمن للسماح للدم و PBS بالخروج. قم بإدارة PBS ببطء أثناء التحقق من لون الكبد للتأكد من أن متدفق تماما. يجب أن يتغير الكبد من لون السلمون الأحمر الغامق إلى اللون الوردي.
   1. في حالة تحضير الأعضاء للأنسجة ، اترك إبرة الفراشة في مكانها ثم قم بتقطيعها ب 20 مل من المثلج البارد بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد. إذا كان الأمر كذلك ، فمن الملائم توصيل المحقنة بمحبس ثلاثي الاتجاهات مع توصيل كلتا المحاقن بها ، وتشغيل الصمام وإيقاف تشغيله أثناء التناوب بين PBS و PFA.
8. حصاد الأعضاء في أنابيب مصنفة وموزونة. بالنسبة للأعضاء الطرفية ، اتبع ترتيبا محددا للحصاد: الكبد والطحال والكلى والرئتين.
   1. خذ فصا واحدا فقط من الكبد ؛ لا يهم أيهما ، ولكن في جميع التجارب ، حاول دائما أن تأخذ نفس الفص بنفس الحجم. وبالمثل ، بالنسبة للكلى والرئتين ، خذ نفس الكلية والرئة. إذا كان من المقرر أيضا إكمال قياس التدفق الخلوي ، فيمكن قطع أي عضو إلى النصف. قم بتخزين النصف المراد استخدامه لقياس الخلايا في وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) في درجة حرارة الغرفة حتى يكتمل الحصاد.
   2. مباشرة بعد الحصاد ، ضع كل عضو في أنبوب مسمى وضعه في حمام الثلج الجاف. يتناقص عيار الفيروس بمرور الوقت في درجة حرارة الغرفة ، لذا فإن مقدار الوقت الذي يستغرقه حصاد الأعضاء مهم للغاية. يجب أن يكون هناك تناسق بين الفئران ، لذلك بعد السلامة ، تكون الأولوية التالية هي السرعة.
      ملاحظه: في حالة حصاد الأعضاء من أجل العيارات الفيروسية ، فمن المفيد جدا أن يكون لديك فرد ثان يحصد الدماغ في هذه المرحلة ، للحفاظ على العيارات الفيروسية.
9. قم بإزالة الأعضاء المتبقية من تجويف جسم الفأر للوصول إلى العمود الفقري والجمجمة.
   1. أخرج الماوس من السبورة وأزل الجلد ، متبوعا بإزالة الذراعين والساقين.
      قم بإزالة رأس الفأر بمقص قطع الرأس أو مقص حاد أو جراحي لحصاد الدماغ عن طريق قطع الجمجمة بمقص LaGrange المسنن من خلال الثقبة العظمى. ثم انزع الجمجمة بالملقط واخرج الدماغ بملعقة.
   2. باستخدام مقص قوي ، قم بإزالة الأضلاع والعظام الأخرى المحيطة بالعمود الفقري. ثم قم بقطع عظم الحوض ، وتعريض الثقبة الفقرية على مستوى أسفل الظهر. يجب أن يكون الطرف الصغير من الحبل الشوكي مرئيا في هذه المرحلة.
   3. استخدم حقنة سعة 10 مل مملوءة ب PBS وإبرة 18 جم لطرد الحبل الشوكي عن طريق "تنظيف" الحبل من أسفل الظهر إلى العمود الفقري العنقي فوق طبق بتري.
   4. بحذر ، ضع الطرف المشطوف للإبرة داخل الثقبة الفقرية ، وتجنب الضغط المفرط لمنع الإبرة من التعدي على جسم العمود الفقري. امسك بقوة لممارسة الضغط على جسم العمود الفقري والإبرة واضغط على مكبس المحقنة لطرد الحبل. انقل الحبل الشوكي على الفور إلى الأنبوب المسمى وضعه في حمام الثلج الجاف.
10. كرر الإجراء مع جميع حتى يكتمل الحصاد. ضع أدوات الحصاد في 70٪ من الإيثانول بين. ركز على الاتساق والسرعة. يجب أن يظل طول الوقت بين كل حصاد عضو ثابتا حتى لا يتحيز نتائج العيار الفيروسي.
11. عند الانتهاء ، قم بتطهير خزانة السلامة الحيوية وجميع المواد قبل إزالتها من منشأة.
12. قم بإزالة كل أنبوب من الحمام الجليدي وقم بوزن الأنابيب لتحديد وزن العضو. لتحديد وزن الأعضاء ، اطرح وزن الأنبوب الفارغ من وزن الأنبوب المحتوي على العضو.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تجميد الأعضاء عند -80 درجة مئوية لمزيد من المعالجة في وقت لاحق أو يمكن تجانس الأعضاء مباشرة قبل تجميد الحصص الفردية. عينات التجميد والذوبان عدة مرات يقلل من عيار الفيروس. لذلك ، من المهم القيام بنفس الإجراء لجميع التجارب في مشروع واحد.

< ص الفئة = "jove_title" >2. تجانس الأعضاء

1. قم بإعداد 3 أنابيب ذات علامات 1.5 مل لكل عضو ليتم تجانسها.
2. إذا لم يتم تجانس العينات مباشرة بعد الحصاد ، فقم بإزالة الأنابيب من -80 درجة مئوية. لا تحتاج العينات إلى إذابة الجليد للتجانس.
3. ضع العينات على الثلج لإبقائها باردة لتقليل فقدان العيار الفيروسي. ثم أضف 1 مل من DMEM البارد الذي يحتوي على 5٪ FBS إلى كل أنبوب يحتوي على عضو.
4. تغلب على الأنابيب على الفور في مضرب حبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تجانس جميع الأعضاء بالخرز الصلب في أداة الخرز الخرز. تحقق للتأكد من أن كل عضو متجانس تماما.
5. قم بتدوير حطام الأعضاء في جهاز ميكرو فوج عند 12,000 × جم لمدة 5 دقائق في جهاز ميكرو تم تبريده إلى 8 درجات مئوية. ثم أعد الأنابيب إلى دلو الثلج. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بنقل العينات إلى أنابيب لإجراء الفحوصات اللازمة. ثم أعد الأنابيب إلى دلو الثلج.
6. لاختبار تشكيل التركيز ، قم بنقل 500 ميكرولتر في أنبوب مسمى. ثم ضع الأنابيب في الرف على دلو ثلج. Aliquot 50 ميكرولتر في أنبوب للحمض النووي الريبي للكمية الفلورية RT-PCR (qRT-PCR) لقياس رقم نسخة الجينوم الفيروسي.
7. اعزل الحمض النووي الريبي الكلي من أعضاء المصابة باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي التجارية. حدد الحمض النووي الريبي الفيروسي للفيروس flavivirus باستخدام مجموعات المسبار التمهيدي الخاصة ب ZIKV ، والتي تتعرف على التسلسلات الفريدة في كل جينوم FLAVIVIRUS. تحديد رقم النسخة الفيروسية باستخدام بلازميد التحكم في النسخ الذي يحتوي على RNA أحادي الشريطة إيجابي محدد تم إنشاؤه في المختبر باستخدام بوليميراز T7 الذي يحتوي على تسلسلات ZIKV المستهدفة.
قم
8. بتقسيم العينة المتبقية ، والتي تبلغ حوالي 300 ميكرولتر ، في الأنبوب الثالث وقم بتخزينها عند -80 درجة مئوية إذا لزم الأمر.
   ملاحظة: إذا لم يتم تجميد العينات مسبقا ، فقم بتجميدها عند -80 درجة مئوية. إذا تم تجميد العينات مسبقا ، فاستمر في التركيز على تشكيل مقايسة و / أو عزل الحمض النووي الريبي قبل التوقف.

فئة

3. فحص تشكيل تركيز فيروس زيكا

ملاحظة: من المهم تضمين تحكم خال من الفيروسات وتحكم إيجابي. المكافحة الإيجابية هي سلسلة تخفيف لمخزون الفيروس بتركيز معروف. لا يلزم أن تكون جميع عناصر التحكم على نفس اللوحة ، ولكن عندما يصبح الاختبار أكبر من 5 لوحات ، يجب إضافة المزيد من عناصر التحكم ونشرها بين اللوحات. احرص على عدم خدش الطبقة الأحادية إما بأطراف الماصة أو بالغسيل القوي. يمكن معايرة أعضاء متعددة في نفس اليوم أو في أيام مختلفة. ومع ذلك ، لا ينبغي معايرة العضو الفردي على مدار عدة أيام لأن ظروف الفحص المختلفة يمكن أن تؤثر على العيار الفيروسي. يوصى بشدة بتشغيل عضو فردي في يوم واحد.

1. قبل يوم الفحص ، قم بإعداد الخلايا والكواشف اللازمة لمقايسة تكوين التركيز.
   1. تحضير وسائط النمو التي تحتوي على 500 مل من DMEM مع 5 مل من HEPES و 25 مل من FBS. تنمو خلايا Vero-World Health Organization (WHO) في وسط النمو عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ قبل بدء الفحص. لا ينبغي أن تكون خلايا Vero ممرا عاليا أو نمت على الإطلاق أكثر من 100٪ قبل بدء الفحص.
   2. قم بإعداد 500 مل من محلول ميثيل السليلوز بنسبة 2٪ عن طريق تعقيم زجاجة وسائط زجاجية سعة 1 لتر مع 10 جم من ميثيل السليلوز ، وشريط تحريك كبير ، وزجاجة وسائط زجاجية منفصلة سعة 1 لتر مع 500 مل من H₂O. إذا تم تبريد الماء المعقم ، فأعد تسخينه في الميكروويف حتى تصبح الزجاجة ساخنة عند لمسها ، ولكن لا تغلي.
   3. صب الماء الدافئ / الساخن برفق في زجاجة من ميثيل السليلوز أثناء وجودك في غطاء زراعة الأنسجة. قم بتغطية الزجاجة جزئيا وحركه على لوح التسخين حتى يصبح ميثيل السليلوز في المحلول (1-4 ساعات). Aliquot 2٪ محلول ميثيل السليلوز في أنبوب مخروطي معقم 50 مل. يمكن تخزين 2٪ ميثيل السليلوز عند 4 درجات مئوية لحين الحاجة.
   4. قم بإعداد محلول بارافورمالدهيد بنسبة 5٪ في PBS لتثبيت الألواح وتخزينه عند 4 درجات مئوية لحين الحاجة. قم بإعداد مخزن مؤقت لغسيل الفحص بتركيز 1x عن طريق إضافة 0.05٪ Triton X-100 إلى PBS وتخزينه في RT. قم بإعداد مخزن مؤقت تلطيخ 1x FFA عن طريق إضافة 1 مجم / مل من الصابونين إلى PBS وتخزينه عند 4 درجات مئوية لحين الحاجة. يمكن تحضيرها قبل أسبوع إلى أسبوعين.
2. احسب عدد ألواح الآبار المسطحة القاع البالغ عددها 96 لوحة الآبار اللازمة للفحص بحيث يتم طلاء كل عضو بثلاث نسخ. قم بتضمين آبار إضافية كافية للضوابط الإيجابية والسلبية.
   1. تنمو ما يكفي من خلايا Vero في وسائط النمو لإكمال الفحص المصمم. قم بتربسين خلايا Vero وعدها وإعادة تعليقها عند 1.5 × 10⁵ خلايا لكل مل في وسط النمو. خلايا Plate Vero في 96 بئر ألواح مسطحة القاع عند 3.0 × 10⁴ خلايا Vero-WHO / بئر في وسائط النمو بإضافة 200 ميكرولتر لكل بئر.
   2. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ بين عشية وضحاها ، وتأكد من أن الألواح مستوية في الحاضنة بحيث يتم توزيع الخلايا بالتساوي داخل البئر.
      ملاحظة: ينمو كل مختبر خلايا Vero بشكل مختلف قليلا. الهدف هو 90-95٪ أحادية الطبقة في كل بئر في يوم اختبار فيروس زيكا.
3. تمييع عينات فيروس زيكا في يوم الفحص. إذا كانت عينات الأعضاء متجانسة مسبقا ، فقم بإزالة العينات من الفريزر -80 درجة مئوية واتركها تذوب قبل وضع العينات على الجليد للفحص.
   1. على الجليد ، قم بإعداد صفيحة بئر مستديرة القاع 96 عن طريق إضافة 180 ميكرولتر من وسط النمو البارد إلى الصفوف من B إلى H مع ترك الصف A فارغا. أضف 150 ميكرولتر من كل عينة عضو متجانسة إلى الصف A من اللوحة السفلية المستديرة.
   2. قم بإعداد تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف لكل عينة، باستخدام ماصة متعددة القنوات. قم بتخفيف العينات في صفيحة بئر مستديرة القاع 96 عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من العينة إلى 180 ميكرولتر من وسائط النمو، وتغيير أطراف الماصة بين كل تخفيف.
4. قم بإعداد لوحة تشكيل التركيز عن طريق إزالة الوسائط من لوحة البئر المسطحة 96 التي تغطي خلايا Vero. افعل ذلك مباشرة قبل إضافة عينات الفيروس لمنع الجفاف أحادي الطبقة.
   1. أضف 100 ميكرولتر من تخفيف الفيروس إلى كل بئر في صفيحة فيرو. أضف عينة باستخدام نفس مجموعة النصائح بالانتقال من أدنى تركيز إلى أعلى تركيز. صفائح الصخور جنبا إلى جنب 2-4 مرات مع الحرص على عدم الدوران.
   2. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 1-2 ساعة. تأكد من أن الألواح مستوية داخل الحاضنة. أثناء الحضانة ، قم بتسخين 2٪ ميثيل سلولوز إلى RT.
   3. تمييع محلول ميثيل السليلوز 2٪ في وسط النمو. يجب أن يكون التخفيف بنسبة 2: 1 تقريبا من 2٪ ميثيل السليلوز إلى وسط النمو. احتفظ بها في درجة حرارة الغرفة حتى يحين وقت استخدامها. أضف 1-2 قطرات / بئر (اضبط الماصة على 125 ميكرولتر) من ميثيل السليلوز: وسط النمو لكل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا.
   4. احتضان 32-40 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. نظرا لأن خلايا Vero لدى كل شخص تنمو بشكل مختلف قليلا ، ويمكن لعوامل بما في ذلك التقاء الخلايا وسلالة فيروس زيكا أن تغير وقت الحضانة.
5. قم بإصلاح خلايا Vero باستخدام محلول بارافورمالدهيد المحضر بنسبة 5٪.
   1. أضف 50 ميكرولتر من 5٪ بارافورمالدهيد إلى كل بئر فوق طبقة ميثيل السليلوز في خزانة السلامة الحيوية. احتضن لمدة 60 دقيقة في RT. يمكن أن يستمر التثبيت طوال الليل عند 4 درجات مئوية ولكن قم بتغطية اللوحة بالبارافيلم لتقليل التبخر.
   2. قم بتفريغ التراكب والوسائط خارج الخلايا في حاوية التخلص داخل خزانة السلامة الحيوية. يغسل برفق باستخدام PBS ، 150 ميكرولتر / جيدا. قم بإزالة PBS من الألواح وإزالة اللوحة من BSL-2.
   3. كرر غسل PBS 2x مع إضافة 150 ميكرولتر / جيدا. ثم قم بإزالة PBS. أضف 150 ميكرولتر / بئر 1x مخزن غسيل FFA واتركه لمدة 5-10 دقائق عند RT لاختراق الخلايا الثابتة.
6. الكشف عن العدوى باستخدام الأجسام المضادة لزيكا الأساسية. تحضير الجسم المضاد الأساسي 4G2 (D1-4G2-4-15) بتركيز 1 ميكروغرام / مل في مخزن تلطيخ FFA. قم بإعداد ما يكفي من الأجسام المضادة للمقايسة بأكملها.
   ملاحظه: ابتعد عن حفاضات المختبر أو غيرها من المواد عالية الامتصاص لأن الألياف ستؤثر سلبا على تصوير البؤر.
   1. قم بإزالة مخزن غسيل FFA من اللواح. أضف 50 ميكرولتر / بئر من الجسم المضاد الأساسي في مخزن تلطيخ FFA. أغلق الألواح بالبارافيلم واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية على منصة هزازة. يمكن إجراء الفحص مع حضانة لمدة 2 ساعة في RT.
7. تصور العدوى بإضافة جسم مضاد ثانوي مترافق ب HRP. قم بإعداد الجسم المضاد الثانوي المضاد للفأر المسمى HRP بتركيز 1: 5,000 في مخزن تلطيخ FFA. قم بإعداد ما يكفي من الأجسام المضادة للمقايسة بأكملها.
   1. اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام المخزن المؤقت للغسيل FFA ، وقم بإزالة مخزن الغسيل عن طريق نقره في الحوض في كل مرة. تلطيخ الخلايا بالجسم المضاد الثانوي في مخزن تلطيخ FFA عند 50 ميكرولتر / بئر. احتضان 1-2 ساعة في RT.
   2. اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام المخزن المؤقت للغسيل FFA ، وقم بإزالة مخزن الغسيل عن طريق نقره في الحوض في كل مرة. أضف 50 ميكرولتر / بئر من ركيزة Trueblue.
   3. راقب اللوحات بعناية ، وانتظر لمدة 2-15 دقيقة حتى يتم تحديد البقع بالكامل والحد الأدنى من الخلفية. بعد أن تظهر البقع ، اغسلها برفق بالماء ، باستخدام يد لحماية الطبقة الأحادية من قوة جريان الماء. اضغط على التجفيف على المناشف الورقية (وليس الحفاضات) والصورة في أسرع وقت ممكن.
   4. يمكن حساب البقع يدويا أو باستخدام عداد فوري آلي. إذا تم عدها يدويا ، يمكن استخدام نطاق التشريح للمساعدة في التصور.
   5. لكل عينة ، حدد مخففا ببؤر مميزة بسهولة (على سبيل المثال ، 20 إلى 200 لكل بئر) واحسب العيار بوحدات تشكيل التركيز لكل مل (FFU / ml) ، باستخدام متوسط الآبار المكررة: FFU / مل = (متوسط البؤر / البئر) × (عامل التخفيف) ÷ (لقاح مل).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1-برومو-3-كلوروبروبان (BCP) جين MRC بي بي 151 حقنة 10cc ثيرمو فيشر العلمي دينار بحريني 309642 إبرة 18 جرام ثيرمو فيشر العلمي 22-557-145 حقنة 1cc TB ثيرمو فيشر العلمي 14-823-16 ح حقنة 20cc ثيرمو فيشر العلمي 05-561-66 24 أنبوب مطحنة ثيرمو فيشر العلمي 15 340 163 3.2 مم حبات الفولاذ المقاوم للصدأ ثيرمو فيشر العلمي NC9084634 حاضنة زراعة الأنسجة 37C نوير 5800 ريال الأجسام المضادة 4G2 في المنزل 96 لوحة قاع مسطح جيدا ميدسكي TP92696 96 بئر لوحات القاع المستديرة ميدسكي TP92697 أنابيب Basix 1.5 مل eppendorf ثيرمو فيشر العلمي 02-682-002 مبيض مبيد للجراثيم المركز ستابلز 30966 قيراط محلل CTL S6 CTL محلل عالمي CTL S6 مقص القطع المنحني أدوات العلوم الدقيقة 14061-11 Dulbecco's Modified Eagle's Alocose متوسط - عالي الجلوكوز مع 4500 مجم / لتر جلوكوز MilliporeSigma د5671 الإيثانول (درجة البيولوجيا الجزيئية) MilliporeSigma e7023 مصل الأبقار الجنينية MilliporeSigma F0926-500 مل ملقط أدوات العلوم الدقيقة 11036-20 حمض الخليك الجليدي MilliporeSigma 537020 الماعز المضاد للفئران المسمى HRP MilliporeSigma 8924 هيبس 1 م MilliporeSigma H3537-100 مل الأيزوبروبانول (درجة البيولوجيا الجزيئية) MilliporeSigma I9516 كوكتيل الكيتامين / الزيلازين الطب المقارن ل-جلوتامين MilliporeSigma جي 7513 طقم تنقية الحمض النووي الريبي Magmax ثيرمو فيشر العلمي AM1830 ميثيل السليلوز MilliporeSigma م 0512 أجهزة الطرد المركزي الدقيقة إيبندورف 5424 ص أنابيب MiniCollect 0.5 مل EDTA بيو ون هاتف: 450480 أنابيب الحلقة O ثيرمو فيشر العلمي 21-403-195 خطوة واحدة q مزيج RT-PCR ثيرمو فيشر العلمي 4392938 بارافورمالدهيد ثيرمو فيشر العلمي نظم الإدارة البيئية - 15713-ق محلول ملحي مخزن بالفوسفات MilliporeSigma D8537-500 مل ماصات Proline متعددة القنوات سارتوريوس 72230/72240 ماصات Proline أحادية القناة سارتوريوس هاتف: 728230 RNAمياه خالية من RNAse ثيرمو فيشر العلمي 10-977-023 RNAzol BD جين MRC RB192 منصة هزاز ثيرمو فيشر العلمي 11-676-333 RPMI 1640 صياد MT10040CV سابونين MilliporeSigma S7900 ملعقة / ملعقة أدوات العلوم الدقيقة 10090-17 مقص القطع المستقيم أدوات العلوم الدقيقة 14060-11 تريتون X-100 MilliporeSigma تي 8787 الركيزة الزرقاء الحقيقية VWR 95059-168 التربسين MilliporeSigma تي 3924-100 مل