آثار إجهاد القص على الصفائح الدموية المعالجة بالأجسام المضادة ضد المستقبلات الحسية الميكانيكية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Quach ، M. E. et al. ، مقايسة قص موحدة لمستقبلات الصفائح الدموية وسطح الخلية البشرية عبر قياس اللزوجة المخروطية. J. Vis. Exp.(2019)

يوضح هذا الفيديو طريقة تقييم تأثير إجهاد القص على الصفائح الدموية. يؤدي العلاج بالأجسام المضادة إلى حدوث تغيرات في التفكك والتوافق في مجمعات المستقبلات الميكانيكية ، مما يؤدي إلى تنشيط الصفائح الدموية والتعبير عن العلامات على السطح. يتم ملاحظة هذه العلامات عن طريق التلوين المناعي وقياس التدفق الخلوي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. سحب الدم وعزل الصفائح الدموية

1. سحب الدم البشري من المتبرعين البالغين الأصحاء عن طريق بزل الوريد في يوم التجربة إلى 3.8٪ سترات ثلاثي الصوديوم. يكفي أنبوب دم واحد سعة 4.5 مل لإنتاج ما يكفي من البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) لمدة 20-25 حالة لدى المتبرعين الذين يقترب عدد الصفائح الدموية لديهم من 250 × 10³ لكل ميكرولتر.
   ملاحظه: تجنب سحب الدم عن طريق الإبر الضيقة (أصغر من 21 جم).
2. قم بإعداد PRP عبر الطرد المركزي عند 22 درجة مئوية و 140 × جم لمدة 12 دقيقة باستخدام فرامل طويلة. سينتج عن ذلك طبقتين متميزتين ، مع خلايا الدم الحمراء في الأسفل والبلازما الغنية بالصفائح الدموية ذات اللون الفاتح في الأعلى.
3. اعزل الطبقة الصفراء العلوية الغائمة من البلازما الغنية بالصفائح الدموية عن طريق سحب العينة بعناية من خلال طرف الماصة المقطوع بزاوية 45 درجة واحصل على عدد الصفائح الدموية عن طريق تعداد الدم الكامل (CBC).
4. إذا لزم الأمر ، اغسل الصفائح الدموية في ملح الصوديوم المخزن 1،4-بيبيرازين ديثانيسولفونيك (PIPES) (150 ملي كلوريد الصوديوم ، كلوريد الصوديوم ، 20 ملي مولار) في وجود البروستاجلاندين E1 (PGE1) ، وأعد تعليقها في عازلة تيرود (134 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.34 ملي فوسفات هيدروجين ثنائي الصوديوم ، Na₂HPO₄ ، 2.9 ملي كلوريد البوتاسيوم ، KCl ، 1 ملي كلوريد المغنيسيوم ، MgCl₂ ، 5 ملي مولار جلوكوز ، 12 ملي بيكربونات الصوديوم ، NaHCO₃ ، 20 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض ، HEPES ، درجة الحموضة 7.35) مع 5 ملي مولار جلوكوز ، وإلا ، انتقل إلى الخطوة 1.5. تصف الخطوات التالية الغسيل باختصار.
   1. اضبط حجم PRP إلى 10 مل باستخدام محلول ملحي مخزن بأنابيب وأضف 0.6 ميكرومتر PGE1.
   2. جهاز الطرد المركزي لمدة 8 دقائق عند 1,900 × جم ، ثم تخلص من المادة الطافية واترك حبيبات الصفائح الدموية تجلس في 400 ميكرولتر من محلول التيرود والجلوكوز لمدة 5 دقائق.
   أعد
   3. تعليق حبيبات الصفائح الدموية برفق واحتفظ بها دون إزعاج لمدة 30 دقيقة.
5. اضبط عدد الصفائح الدموية على ~ 250 × 10³ صفائح ضفائح ضفائحية لكل ميكرولتر مع البلازما البشرية الفقيرة بالصفائح الدموية (PPP) وحافظ على التعليق عند 22 درجة مئوية دون إزعاج أو تحت دوران لطيف.

فئة

2. الأجسام المضادة ومعالجة القص الموحدة

ملاحظة: يجب أن تتم جميع الخطوات الواردة في القسم 2 التي تتطلب سحب العينات ببطء، حتى لا يتم إدخال أي قص.

1. أضف الجسم المضاد المطلوب إلى البلازما الغنية بالصفائح الدموية أو الصفائح الدموية المغسولة واخلطها برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل أو التقليب باستخدام طرف ماصة. اتركه دون إزعاج في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق. أضف حجما مكافئا من PPP أو المخزن المؤقت ل Tyrode إلى عنصر تحكم سالب.
2. قم بتشغيل مقياس اللزوجة المخروطية ، واضبط درجة حرارة اللوحة على 22 درجة مئوية ، واترك الوقت للسماح للوحة بالوصول إلى درجة الحرارة هذه.
3. قم بضرب البلازما الغنية بالصفائح الدموية المعالجة أو الصفائح الدموية المغسولة على مقياس لزوجة اللوحة المخروطية التي يتم التحكم في درجة حرارتها مباشرة في وسط اللوحة. تأكد من ترسيب كل العينة بين المخروط واللوحة عند نقطة التلامس ، وليس على السطح الخارجي لحافة المخروط.
4. القص بمعدل ومدة مناسبين.
   1. احسب القص كما هو موضح في دليل مقياس اللزوجة، أو كما هو موضح سابقا.
   2. تحديد معدل القص من اللزوجة وإجهاد القص المطلوب عبر قانون نيوتن للزوجة ؛ ؛ لزوجة البلازما هي 1.5-1.6 سنتيبواز (cP). على سبيل المثال ، نطاق القص العادي للدوران البشري هو 5-30 دينار / سم² ، ويجب تطبيق القص على مقياس الوقت المكون من رقم واحد.
5. ارفع المخروط عن اللوحة قليلا (~ 2 مم) بحيث تظل العينة ملامسة لكل من اللوحة والمخروط واستخدم تحميل هلام أو طرف ماصة طويل آخر لتجميع 5-10 ميكرولتر من مركز حجم العينة.
6. احتضان العينات المنفصمة بالعلامات المرغوبة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بالنسبة لعلامات التعرض للفوسفاتيديل سيرين ، β-جالاكتوز ، و P-selectin ، استخدم مجال Lactadherin C2 (LactC2) عند 0.08 ميكرومتر ، و Erythrina cristagalli lectin (ECL) عند 6.25 ميكروغرام / مل ، والجسم المضاد ل P-selectin (20 ميكروغرام / مل) ، على التوالي.
7. قم بإصلاح العينات في 2٪ بارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة في RT قبل التخفيف أو التخزين البارد وانتقل إلى الخطوة 3.1 أو قم بتخزين العينات عند 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 12 ساعة.

< p class = "jove_title" >3. الكشف عن علامات السطح والتشابك عبر قياس التدفق الخلوي

1. قم بتحليل العينة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، واجمع ما لا يقل عن 20,000 حدث لكل حالة.
قم
2. بتقدير شدة الإشارة لعلامات الفلورسنت باستخدام قيمة الارتفاع لشدة كل فلوروفور ، أو المتوسط الهندسي لشدة التألق (MFI).
3. إذا كنت تهدف إلى اكتشاف تشابك الصفائح الدموية بعد معالجة القص ، فقم بتحليل العينة على مقياس تدفق خلوي قادر على التصوير وقم بتحديد التشابك حسب معلمات المساحة ونسبة العرض إلى الارتفاع.
   1. ارسم رسم بياني للمساحة و / أو نسبة العرض إلى الارتفاع.
   2. استخدم التحكم السلبي مع ألبومين مصل الأبقار (BSA) أو السيارة لرسم بوابة باستثناء معظم الأحداث الدائرية بالكامل (عادة ما يتم رسم هذه البوابة بنسبة عرض إلى ارتفاع ~ 0.8) وتحديد النسبة المئوية للأحداث داخل هذه البوابة. من المرجح أن تكون الأحداث ذات نسبة العرض إلى الارتفاع المنخفضة مترابطة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات APC مضاد للإنسان CD62P (P-Selectin) بيو ليجند 304910 بروكفيلد كاب 2000+ مقياس اللزوجة بروكفيلد - ليكتين Erythrina cristagalli المترافق FITC (ECL) مختبرات ناقلات [إل -1141] البلازما البشرية الطبيعية المجمعة الدقة البيولوجية CCN-10 أنبوب جمع الدم باللون الأزرق الفاتح (سترات الصوديوم) دينار بحريني 369714 طقم جمع الدم بالمكنسة الكهربائية ، إبرة 21 جم × 3/4 بوصة دينار بحريني 367287