اختبار في المختبر لتحديد نمو الطفيليات داخل الخلايا في البلاعم

الملخص

المصدر: Sarkar، A.، et al. القياس الكمي للنمو داخل الخلايا داخل البلاعم هو طريقة سريعة وموثوقة لتقييم ضراوة طفيليات الليشمانيا. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو فحصا لتحديد النمو داخل الخلايا للطفيليات في الضامة المشتقة من نخاع العظام (BMMs). تصاب خلايا البلاعم بالمراحل الغازية المتحركة وغير المتحركة من الليشمانيا ، والبروماتيجوت metacyclic و amastigotes ، على التوالي. تغزو الطفيليات الضامة ، وتتداخل في فجوة طفيلية وتتكاثر في الداخل. يتم قياس نمو الطفيليات داخل الخلايا باستخدام مجهر عند تلطيخ البلاعم ونواة الطفيليات بالفلورسنت.

البروتوكول

فئة

1. طلاء BMMs على أغطية للعدوى

1. قم بإعداد ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار عن طريق وضع أربعة (4) أغطية زجاجية معقمة مقاس 12 مم (معقمة ومخزنة في وعاء زجاجي مغلق) في قاع كل بئر فارغة.
   ملاحظه: اختر كل غطاء معقم مقاس 12 مم بطرف شفط مثبت على خط تفريغ. ضع الغطاء في الآبار دون تداخل ، وحررها في الموضع المطلوب عن طريق الضغط على الأنبوب لمقاطعة الفراغ.
2. وسائط الشفط (وأي خلايا غير ملتصقة) من أطباق بتري المغلفة بالبلاعم الملتصقة المشتقة من نخاع العظام وشطف الخلايا الملتصقة برفق 2x باستخدام محلول ملحي معقم من فوسفات Dulbecco بدون كالسيوم وكلوريد المغنيسيوم (PBS -/-) دافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
3. أضف 5 مل معقمة 1x PBS -/- بتركيز نهائي قدره 1 ملي مولار EDTA لكل طبق بتري واحتضنه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل BMMs الملتصقة. تحقق من فصل الخلايا باستخدام المجهر.
4. اجمع جميع الخلايا المنفصلة المعلقة في 1x PBS -/- مكملة بحمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) 1 ملي مولار في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اشطف كل طبق 2x مع 5 مل PBS -/- وأضفه إلى تجمع تعليق الخلية.
   ملاحظه: يمكن تخفيف تعليق الخلية باستخدام PBS إضافي -/- لحماية البلاعم من سمية EDTA أثناء عملية التجميع.
5. جهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق البلاعم في وسط 5-10 مل BMM عن طريق سحب العينات. ضع الخلايا المعلقة على الجليد لمنع الالتصاق بالأنابيب والتكتل.
6. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام استبعاد Trypan blue في مقياس كثافة الدم.
   ملاحظه: لحساب خلايا BMM المعلقة في وسط 5 مل ، يسمح مزيج التخفيف من 25 ميكرولتر من تعليق الخلية في 445 ميكرولتر PBS -/- و 30 ميكرولتر 0.4٪ محلول تريبان الأزرق عادة بالقياس الكمي السهل في مقياس كثافة الدم (مع مراعاة عامل تخفيف 20x للحساب النهائي). عد فقط الخلايا التي لم تلطخ باللون الأزرق التريبان (خلايا قابلة للحياة). قد يتغير حجم تعليق الخلية إذا كان هذا الخليط شديد التركيز أو المخفف. بشكل عام ، يتراوح إنتاجية BMM لكل مستحضر بين 2 × 10⁷ و 5 × 10⁷ خلايا من فأر واحد.
7. قم بإعداد تعليق الخلية في وسط BMM بتركيز الطلاء المطلوب (5 × 10⁵ / مل) وتفريق التعليق إلى 6 ألواح بئر في وسط 2 مل لكل بئر بحيث يتلقى كل بئر 1 × 10⁶ ضامة.
   ملاحظه: هذه خطوة حاسمة تضمن حصول كل بئر على العدد الكافي من البلاعم لتغطية الغطاء بشكل موحد. تأكد من أن الغطاء في الآبار غير متداخل أو يطفو في الوسط. إذا كان الأمر كذلك ، فاضبطه برفق باستخدام طرف ماصة معقمة.
8. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

< p class = "jove_title" >2. تنقية الأشكال المعدية ل L. amazonensis

ملاحظة: تحضير الليشمانيا للعدوى - قم بتنقية البروماستيجوت المتحولة الحلقية من مزارع promastigote الثابتة أو تمييز promastigotes في الثقافة إلى شكل amastigote باستخدام بروتوكول التمايز المحوري L. amazonensis.

1. تنقية اللوماتستيجوت المتحولة ليشمانيا باستخدام وسائط تدرج الكثافة (المواد)
   1. قم بإعداد محلول مخزون بنسبة 40٪ من وسائط التدرج الكثافة في ماء معقم وخالي من السموم الداخلية.
   محلول
   2. تدرج الكثافة المخفف في وسط 10x M199 (بدون مصل) لتحضير تركيز 10٪ في وسط M199.
   3. تصفية جميع الحلول من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظه: يمكن تخزين محاليل المخزون عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة لا تزيد عن شهر واحد.
   4. أضف 2 مل من محلول وسائط التدرج الكثافة بنسبة 40٪ في قاع أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل.
   5. طبقة 2 مل من محلول وسائط التدرج الكثافة بنسبة 10٪ في M199 فوق طبقة الوسائط المتدرجة كثافة 40٪ بعناية، باستخدام ماصة باستور لتجنب أي خلط بين الطبقتين.
   6. اجمع 1 × 10⁹ طفيليات من استزراع الطور الثابت عن طريق الطرد المركزي عند 1,900 × جم لمدة 10 دقائق.
   7. أعد تعليق الخلايا في الوسط الأساسي المعدل (DMEM) من Dulbecco سعة 6 مل.
   8. طبقة 2 مل من تعليق الخلية مباشرة فوق طبقة الوسائط المتدرجة الكثافة 10٪، برفق، باستخدام ماصة باستور لتجنب الاختلاط بين الطبقات.
   9. جهاز الطرد المركزي التدرج لمدة 10 دقائق عند 1,300 × جم في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظه: نظرا للاختلافات في الخصائص الفيزيائية بين أنواع الليشمانيا ، قد يتعين تعديل ظروف الطرد المركزي لكل منها بشكل طفيف لضمان أقصى إنتاجية.
   10. اجمع الطفيليات (المخصبة في شكل بروماستيجوت metacircleic) من النطاق المتكون عند الحد العلوي لوسط التدرج الكثافة 10٪ (الواجهة بين طبقات وسائط التدرج الكثافة 0٪ و 10٪).
   11. تمييع الطفيليات بحجم واحد من DMEM وتجميعها بالطرد المركزي (1,900 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة).
   12. أعد التعليق في وسط DMEM سعة 500 ميكرولتر واعدها في مقياس كثافة الدم لتحديد المحصول.
2. توليد L. amazonensis amastigotes في ظل ظروف الثقافة المحورية (درجة الحموضة المنخفضة / درجة الحرارة المرتفعة).
   1. امزج 5 مل من مزرعة بروماستيجوت في الطور اللوغاريتمي (درجة الحموضة 7.4 عند 26 ^درجةمئوية) مع حجم متساو من وسط amastigote (درجة الحموضة 4.5) ، باستخدام 25 سم² قوارير (إجمالي 10 مل متوسط) واحتضانها عند 26 درجة مئوية طوال الليل.
   2. قم بتحويل القارورة من 26 درجة مئوية إلى 32 درجة مئوية.
   3. بعد 3 أو 4 أيام ، قم بتقسيم الثقافة 1: 5 في وسائط amastigote عند 32 درجة مئوية.
   4. افحص الطفيليات في الأيام الثلاثة إلى الأربعة القادمة (بحد أقصى 7 أيام) لمعرفة ما إذا كانت جاهزة للاستخدام في العدوى.
      ملاحظه: يجب أن يكون للأسيستيغوت المحورية الصحية شكل بيضاوي ، بدون سوط مرئي. الآماستيجوت المتمايزة جزئيا لها شكل بيضاوي كبير مع سوط قصير. لا ينبغي أن تحتوي الثقافة على الكثير من الكتل - فالعديد من الكتل هي مؤشر على الطفيليات غير النامية والمحتضرة. يمكن تقسيم ثقافة amastigote 1: 5 والحفاظ عليها لمدة أقصاها 3 أسابيع.

< p class = "jove_title" >3. الإصابة ب L. amazonensis

1. معلقات الطفيليات المخففة وفقا لوزارة الداخلية المطلوبة (عادة 3-5 promastigotes metacyclic لكل بلاعم [MOI من 1: 3 أو 1: 5] و 1 amastigote لكل بلاعم [MOI 1: 1]). أضف الليشمانيا في PBS -/- بحجم 50 - 100 ميكرولتر لكل بئر يحتوي بالفعل على 2 مل متوسط.
2. احتضان BMMs لمدة 1 ساعة مع amastigotes و 3 ساعات مع promastigotes metacyclic عند 34 ^{درجة مئوية}للعدوى.
   ملاحظه: قد تختلف درجة حرارة العدوى المثلى حسب الأنواع.
3. بعد الحضانة ، اغسل الطفيليات الحرة جيدا في كل بئر 3x مع 2 مل PBS -/- تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية
   ملاحظه: قم بتفريق PBS برفق للتأكد من أن الأغطية لا تطفو فوق بعضها البعض. حرك اللوحة برفق ثم استنشق السائل. استخدم أطراف شفط منفصلة في حالة استخدام سلالات متعددة من الطفيليات لتجنب التلوث المتبادل.
4. قم بإصلاح عينات النقطة الزمنية لمدة 1 ساعة أو 3 ساعات عن طريق احتضان كل بئر ب 1.5 - 2 مل من 2٪ PFA في PBS -/- لمدة 10 دقائق. لا تشفط الغسيل الأخير وقم بتبريد الأطباق التي تحتوي على أغطية في PBS حتى تلطيخها.
5. أضف 2 مل من وسط BMM الطازج إلى كل بئر على الأطباق لمزيد من النقاط الزمنية واحتضانها عند 34 درجة مئوية.
6. قم بإصلاح النقاط الزمنية المتبقية حسب الرغبة كما هو موضح في الخطوة 4.3 ، وقم بتبريد الأطباق حتى تلطيخها.

فئة

4. تلطيخ DAPI وتركيب الغطاء

1. قم بشفط PBS من الآبار التي تحتوي على أغطية وأضف 1.5 مل PBS -/- مع 0.1٪ منظف غير أيوني. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بغسل 3 مرات مع 2 مل PBS -/-.
2. أضف 1 مل PBS -/- مع 2 ميكروغرام / مل 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (مخفف من محلول مخزون 5 مجم / مل في الماء) إلى الآبار التي تحتوي على أغطية واحتضانها لمدة ساعة أخرى في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: يعد وقت الحضانة باستخدام DAPI أمرا بالغ الأهمية للتصور الصحيح لطفيليات الليشمانيا داخل الخلايا. تلطخ نوى البلاعم بسرعة ، نظرا لحجمها الأكبر ومحتواها من الحمض النووي ولكن تلطيخ نوى الطفيليات داخل الخلايا يكون أبطأ. وبالتالي ، فإن تمديد وقت الحضانة إلى ما هو مطلوب لتصور نوى BMM ضروري للسماح ل DAPI بالتغلغل عبر غشاء البلازما الطفيلي والغشاء النووي الطفيلي. مع صبغة DAPI المناسبة ، يمكن أيضا تصور الحمض النووي الحركي للميتوكوندريا بالقرب من جيب السوط للطفيلي ، بالإضافة إلى الحمض النووي النووي.
3. اغسل كل بئر يحتوي على أغطية 3x باستخدام 2 مل PBS -/- ثم ارفع الغطاء واقلبه بالملقط لوضع جانب الخلية لأسفل وتثبيته على شرائح المجهر الزجاجي باستخدام كاشف تثبيت مضاد للبهتان متوفر تجاريا.
   ملاحظه: أغطية الهشة للغاية وتحتاج إلى معالجة حذرة. تجنب الضغط عليها ، خاصة على الجدار الجانبي للآبار عند الرفع. تؤدي إضافة بضع قطرات من PBS -/- إلى تقليل التوتر السطحي بين الغطاء والبئر وتسهيل عملية الرفع. يمكن استخدام إبرة قياس دقيقة للمساعدة في استخراج الغطاء من قاع البئر. بعد وضع غطاء على الشريحة ، اضغط برفق لأسفل باستخدام ملقط لدفع أي فقاعات هواء في وسائط التثبيت. إذا كان الغطاء مكسورا أو ربما انقلب أثناء عملية الرفع ، فلا تقم بإعادة التركيب. ما عليك سوى استخدام الغطاء الرابع الاحتياطي.
4. ضعي الشرائح في الثلاجة حتى القياس الكمي.

< p class = "jove_title" >5. القياس الكمي للعدوى

1. افحص الشرائح الملطخة ب DAPI تحت المجهر الفلوري من خلال التركيز على البلاعم باستخدام عدسة موضوعية 100X مع زيت الغمر (الإثارة عند 358 نانومتر ؛ الانبعاث الأمثل عند 461 نانومتر).
   تأكد من أن التركيز ينصب على طبقة البلاعم بين الشريحة الزجاجية والغطاء.
2. حدد عدد البلاعم (النوى الكبيرة الملطخة ب DAPI) وعدد نوى البلاعم الأصغر المتجمعة حول كل نواة ضامة (انظر الشكل 1 أ ، DAPI) لكل مجال رؤية ، باستخدام عداد يدوي.
   ملاحظه: قد لا تكون جميع نوى Amastigote مرئية في مستوى واحد من التركيز نظرا لصغر حجمها. احسب تلك التي تكون مرئية عند التركيز على نوى البلاعم ، ثم استخدم التركيز الدقيق للتحقق من نوى الطفيليات في مستويات أعلى وأسفل نوى البلاعم.
3. انتقل إلى مجال رؤية آخر لتكرار القياس الكمي. استخدم مفتاح عداد منفصل لتتبع عدد الحقول التي تم جربها. تنقل عبر الحقول المرئية في صفوف متوازية عبر كل قسيمة غطاء، لمنع تداخل العد.
4. حدد ما لا يقل عن 200 بلاعم لكل قسيمة غطاء. حدد كل نقطة زمنية للعدوى بثلاث نسخ (3 أغطية). عد الغطاء الرابع إذا كان أحد الأجزاء السابقة غير مناسب للعد بسبب تداخل الغطاء ، أو التركيب السيئ ، أو كسر الزجاج ، وما إلى ذلك <br / > ملاحظه: إذا تعذر حساب 200 وحدة من البلاعم على أي غطاء واحد ، فاحسب الربع الاحتياطي.
5. احسب معدلات الإصابة على أنها / بلاعم أو أماستيجوت / 100 ضامة وحدد النسبة المئوية للبلاعم المصابة من بيانات القياس الكمي الأولية.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: توضيح تمثيلي لعدوى BMM مع amastigotes axenic الخبيثة (A) وpromastigotes غير الخبيثة في المرحلة اللوغاريتمية (B) من L. amazonensis. صور التألق المناعي للبلاعم المعزولة من الفئران BALB / c ، 1 ساعة و 48 ساعة بعد الإصابة. تمت معالجة البلاعم المصابة للتألق المناعي كما هو موضح في البروتوكول. تم تلطيخ الأغشية الكهروضوئية بجسم مضاد أحادي النسيلة Lamp1 المضاد للفئران (تخ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 6 لوحة ثقافة خلية جيدة سيلستار 657160 الادنين أكروس أورجانكس AC147440250 أطراف ماصة حاجز الهباء الجوي (100-1000 ميكرولتر) فيشربراند 02-707-404 أطراف ماصة حاجز الهباء الجوي (20-200 ميكرولتر) فيشربراند 02-707-430 أطراف ماصة حاجز الهباء الجوي (2-20 ميكرولتر) فيشربراند 02-707-432 شفرة جراحية من الفولاذ الكربوني من Bard-Parker Rib-Back # 10 أسبن الجرافيكي هاتف: 371110 BD Luer-Lok Tip 10 مل حقنة بيكتون ديكنسون (دينار بحريني) 309604 إبرة BD Precisionglide ، 25 جرام بيكتون ديكنسون (دينار بحريني) 305124 صحن زراعة الخلية 35 مم × 10 مم سيلستار 627 160 قارورة ثقافة الخلية سيلستار 660175 نظارات الغطاء: دوائر 12 مم فيشربراند 12-545-80 DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole، ثنائي هيدروكلوريد) إنفيتروجين د1306 د-بيوتين جي تي بيكر سي 272-00 EDTA سيجما ألدريتش EDS الكحول الإيثيلي 200 دليل فارمكو AAPER 111000200 فالكون 100 مم × 15 مم صحن بتري بوليسترين غير معالج ب TC كورنينج 351029 مصل الأبقار الجنينية سيراديجم 1500-500 فيكول 400 سيجما ألدريتش F8016 المجهر الفلوري نيكون E200 الماعز المضادة للفأر IgG تكساس الأحمر إنفيتروجين تي -862 الماعز المضادة للأرانب IgG AlexaFluor488 إنفيتروجين أ -11034 هيمين طوكيو للصناعة الكيميائية المحدودة H0008 هيبس (1 م) جيبكو هاتف: 15630-080 مخفف Isoton II بيكمان كولتر 8546719 ل-جلوتامين الجوزاء 400-106 متوسط 199 (10X) جيبكو 11825-015 البيروفات الصوديوم (100 مل) جيبكو هاتف: 11360-070 بارافورمالدهيد ألفا إيسار هاتف: 43368 البنسلين / الستربتومايسين الجوزاء 400-109 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (-/-) ثيرموفيشر 14200166 أنابيب الطرد المركزي المخروطية من مادة البولي بروبلين 15 مل سيلستار 188 271 أنابيب الطرد المركزي المخروطية من مادة البولي بروبلين 50 مل سيلستار 227 261 إطالة كاشف الذهب المضاد للبهتان ثيرموفيشر ص36930 الجسم المضاد للفئران المضاد للفئران مصباح -1 دراسات التطور بنك الورم الهجين 1د4 ب M-CSF البشري المؤتلف بيبروتك 300-25 مقياس الدم Reichert Bright-Line هوسر العلمية 1492 RPMI متوسط 1640 (1X) جيبكو 11875-093 تريتون X-100 الفاعل بالسطح ميليبور سيجما TX1568-1 تريبان بلو سيجما ألدريتش تي 8154 مقص دقيق ، 4 1/2 بوصة VWR 82027-582 تشريح الملقط ، طرف ناعم VWR 82027-386 شرائح المجهر VWR 16004-368 Z1 كولتر عداد الجسيمات ، عتبة مزدوجة بيكمان كولتر 6605699