$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< ص الفئة = "jove_title" >
1. تحضير البكتيريا
ملاحظة: تستخدم الركائز البكتيرية ذات الخلية الكاملة والببتيدوغليكان المنقى كركائز إنزيمية في كل من مقايسة انتشار الشرائح الدقيقة ومقايسة إطلاق الصبغة. تتطلب هذه الركائز التحضير قبل إجراء تفاعلات الإنزيم. يصف البروتوكول التالي إعدادهم.
- ركيزة الخلية البكتيرية الكاملة
- إنتاج ركيزة الخلايا البكتيرية عن طريق تلقيح 500 مل من مرق المغذيات مع 2 مل من المزرعة الليلية من Bacillus subtilis 168 (مجموعة الثقافة من النوع الأمريكي ؛ ATCC 23857). احتضان عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز (125 دورة في الدقيقة) حتى تصل المزرعة إلى مرحلة النمو الأسي ، والتي تعرف بأنها مرحلة نمو سريعة تؤدي إلى مضاعفة الثقافة البكتيرية. لزراعة السالمونيلا المعوية subsp. المعوي (ATCC 10708) ، استخدم مرق المغذيات كوسيط نمو عند 37 درجة مئوية مع الرج (125 دورة في الدقيقة).
- اقتل كل مزرعة بالحرارة عن طريق التعقيم لمدة 10 دقائق عند 121 درجة مئوية تحت ضغط 3 ضغط جوي.
- احصد الركيزة البكتيرية المقتولة بالحرارة عن طريق الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة عند 5,000 × جم. اغسل الحبيبات ثلاث مرات بالماء من النوع 1 وأعد تعليقها في كمية قليلة من الماء. في هذه الدراسة ، قم بتعليق الركائز في 1,200 ميكرولتر.
- Aliquot 300 ميكرولتر من ركائز الخلايا البكتيرية إلى 1.5 مل أنابيب microfuge وتخزينها في 20 درجة مئوية.
فئة
2. وضع العلامات على الركيزة - Remazol Brilliant Blue R Dye Labeling
ملاحظة: في مقايسة إطلاق الصبغة ، ترتبط الركيزة تساهميا بصبغة Remazol الزرقاء الرائعة R. يصف البروتوكول التالي تحضير ركائز الإنزيم المصبوغة.
- اصنع محلول هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بسعة 250 ملي مولار عن طريق إذابة 1 جم من هيدروكسيد الصوديوم في 99 مل من الماء من النوع الأول لاستخدامه في صنع محلول صبغة ريمازول الزرقاء الرائعة (RBB) سعة 200 ملم.
- اصنع محلول 200 ملي مولار من الرنين الحميد عن طريق إذابة 1.25 جم من النخيل الحميد في 98.75 مل ± 1 مل من محلول هيدروكسيد الصوديوم الطازج سعة 250 ملم.
- أعد تعليق الخلايا البكتيرية المقتولة بالحرارة بتركيز 0.5 جم من الوزن الرطب في 30 مل من محلول المبارات المائية. بالنسبة للببتيدوغليكان المنقى ، أعد تعليق الببتيدوغليكان بتركيز 0.3 جم من الوزن الرطب في 30 مل من محلول RBB.
- احتضان خليط التفاعل في قارورة Erlenmeyer على منصة دوارة لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية مع خلط لطيف.
- انقل خليط التفاعل إلى حاضنة 4 درجات مئوية واحتضنه لمدة 12 ساعة إضافية مع الخلط اللطيف.
- بعد الحضانة ، قم بحصاد الركيزة المصبوغة عن طريق الطرد المركزي عند 3,000 × جم لمدة 30 دقيقة. صب محلول الصبغة من حبيبات الركيزة.
- قم بإزالة الصبغة القابلة للذوبان غير المرتبطة تساهميا من الركائز عن طريق غسل الخلايا المسماة بالصبغة أو الببتيدوغليكان بشكل متكرر (حوالي 3-5 غسلات) بالماء من النوع الأول متبوعا بالطرد المركزي. مع كل إضافة ماء, أعد تعليق الحبيبات جيدا.
ملاحظه: عندما تكون غير مرتبطة ، لم تعد الصبغة القابلة للذوبان مرئية في الغسيل المائي بعد الطرد المركزي. يجب إعطاء الركيزة غسل إضافي واحد. لاحظ أن الركيزة ستبقى زرقاء ، في حين أن المادة الطافية للغسيل الأخير ستكون واضحة.
- قم بتخزين الركائز المصبوغة المعلقة في كمية قليلة من الماء عند -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
فئة
3. فحص إطلاق الصبغة الكمي
ملاحظة: أثناء مقايسة إطلاق الصبغة ، يؤدي التحلل المائي للركيزة المصبوغة ب RBB في التفاعل الأنزيمي إلى إطلاق المنتجات المصبوغة في المادة الطافية للتفاعل. يشير القياس اللوني لكمية الصبغة المنبعثة إلى مقدار النشاط الأنزيمي الموجود داخل العينة لإنزيم معين. تسمح الطريقة الكمية بمقارنة الإنزيمات المختلفة عبر الركائز وتسمح بتغيير الظروف البيئية التي تؤثر على التفاعل الأنزيمي (على سبيل المثال ، درجة الحرارة والملوحة ودرجة الحموضة). يصف البروتوكول التالي إعداد وأداء مقايسة إطلاق الصبغة للكشف الكمي عن النشاط الأنزيمي لمضادات الميكروبات البروتينية.
- التحضير لفحص إطلاق الصبغة
- اسمح للركيزة المصبوغة المجمدة بالعودة إلى درجة حرارة الغرفة وغسلها مرتين باستخدام مخزن الفحص المؤقت (محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، PBS) ، والذي يتم تحديده تجريبيا للإنزيم المحدد.
- احسب حجم تعليق الركيزة المطلوب بضرب حجم تفاعل 200 ميكرولتر في عدد فحوصات إطلاق الصبغة التي سيتم إجراؤها.
- قم بإعداد تعليق الركيزة عن طريق إضافة الركيزة المصبوغة إلى حجم المخزن المؤقت للفحص ، المحدد في 4.1.2 ، حتى يتم تحقيق كثافة بصرية (OD) تبلغ 2.0 عند 595 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. للبقاء ضمن الحدود الوظيفية لمقياس الطيف الضوئي ، قم بقياس 2.0 OD595 ك 1.0 لتخفيف 1: 1 للمحلول المركز. استخدم المخزن المؤقت للفحص كفارغ.
ملاحظه: يمكن رفع تعكر الركيزة للتفاعل إلى ما بعد 2.0 لتتناسب مع مستويات نشاط الإنزيمات عالية الكفاءة.
- قم بتعليق البروتين المضاد للميكروبات المراد تقييمه في مخزن مؤقت للفحص بتركيز تقديري قدره 1 مجم / مل.
- باستخدام مقايسة الصفيحة الدقيقة لمجموعة فحص البروتين بحمض البيسنشونيك (BCA) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، حدد التركيز الفعلي لعينة البروتين المراد فحصها. اضبط تركيز تعليق المخزون على 1 مجم / مل باستخدام المخزن المؤقت للفحص.
- استخدام مقايسة إطلاق الصبغة لتحديد ظروف الحضانة المثلى لبروتين مضاد للميكروبات
- قم بتخفيف معلق البروتين المضاد للميكروبات إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر. يعطي هذا التركيز كتلة تفاعل نهائية تبلغ 1 ميكروغرام من البروتين لكل حجم (10 ميكرولتر) مضافة إلى تفاعل الفحص.
- تحديد النطاق الحراري المراد تقييمه للبروتين المحلل للجراثيم. تضمن النطاق الحراري في هذه المقايسات 5 درجات مئوية و 15 درجة مئوية و 25 درجة مئوية و 35 درجة مئوية و 45 درجة مئوية و 55 درجة مئوية و 65 درجة مئوية.
- قم بإجراء فحوصات التفاعل في أنابيب الطرد الدقيق سعة 0.5 مل. لكل حالة حرارية ، أضف 10 ميكرولتر من بروتين المخزون إلى 200 ميكرولتر من تعليق الركيزة المحضر.
- احتضن في جهاز تدوير حراري لمدة 8 ساعات مع الخلط عن طريق الانعكاس مرة واحدة في الساعة.
- بعد الحضانة ، أوقف ردود الفعل بإضافة 25 ميكرولتر من الإيثانول.
- قم بإزالة الركيزة غير المهضومة وغير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي عند 3,000 × جم لمدة دقيقتين ، وانقل 150 ميكرولتر من المادة الطافية للتفاعل لكل خليط تفاعل إلى صفيحة دقيقة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا ، مع الحرص على عدم تعطيل حبيبات الركيزة غير المهضومة.
- قم بقياس النشاط الأنزيمي للبروتين المضاد للميكروبات للركيزة المحددة عن طريق تحديد كمية صبغة RBB القابلة للذوبان المنتفكة عن الركيزة بعد التحلل المائي الأنزيمي. لتحديد النشاط الأنزيمي ، قم بقياس امتصاص المادة الطافية عند 595 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي الدقيق. زيادة الامتصاص بواسطة الصبغة القابلة للذوبان التي يتم إطلاقها في المادة الطافية من الركيزة المسماة هي قياس كمي للنشاط الأنزيمي. < / >
ملاحظه: يتم تمثيل التغير في الامتصاص بوحدات النشاط (AU) ، حيث ينتج عن 1 AU زيادة 0.01 في الكثافة البصرية للطافي لتفاعل إطلاق الصبغة عند 595 نانومتر. يتم استخدام تفاعل فارغ ، محتضن بجميع مكونات التفاعل باستثناء الإنزيم ، لطرح أي صبغة يتم إطلاقها من الركيزة المسماة RBB بسبب الحضانة. توفر درجة الحرارة الأنزيمية المثلى قياس وحدة نشاط الذروة.