مقايسة لوحة موضعية لتقييم استجابات الإجهاد التأكسدي في السلالات البكتيرية

الملخص

المصدر: Ketelboeter ، L. M. et al. ، طرق لتثبيط إنتاج البيوميلانين البكتيري وتحديد الزيادة المقابلة في الحساسية للإجهاد التأكسدي. J. Vis. exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو مقايسة لوحة موضعية مصممة لتقييم استجابات الإجهاد التأكسدي للسلالات البكتيرية. تنتج بعض السلالات البيوميلانين ، وهو صبغة مضادة للأكسدة. على العكس من ذلك ، فإن السلالات المعالجة بعامل اختبار ، مما يؤدي إلى انخفاض إنتاج البيوميلانين ، تظهر قابلية متزايدة للإجهاد التأكسدي ، مما يؤدي إلى انخفاض قابلية الخلايا للحياة مقارنة بالسلالات المنتجة للبيوميلانين.

البروتوكول

فئة

1. تحضير وسائط الثقافة والمضادات الحيوية و 2- [2-nitro-4- (trifluoromethyl) benzoyl] -1،3-cyclohexanedione (NTBC)

1. اصنع مرق لوريا بيرتاني (LB) (1٪ تربتون ، 0.5٪ مستخلص خميرة ، 0.25٪ كلوريد الصوديوم ، كلوريد الصوديوم في H₂O) وتناول كميات مناسبة. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
2. اصنع 100 مل من أجار LB (1٪ تربتون ، 0.5٪ مستخلص خميرة ، 0.25٪ كلوريد الصوديوم ، 1.5٪ أجار في H₂O) في قوارير 250 مل. تعقيم بالأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. تأكد من ذوبان الأجار قبل سكبه في أطباق.
   ملاحظه: ستنتج القوارير التي تحتوي على 100 مل من LB agar 4 أطباق. يمكن تغيير كمية LB أجار لتتوافق مع عدد اللوحات اللازمة للمقايسة.
3. اصنع محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، PBS (137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد البوتاسيوم ، KCl ، 10 ملي فوسفات هيدروجين ثنائي الصوديوم ، Na₂HPO₄ ، 2 ملي فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم ، KH₂PO₄). تعقيم عن طريق الأوتوكلاف أو الترشيح وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
4. تحضير محاليل مخزون المضادات الحيوية للجنتاميسين والكاناميسين وتوبراميسين.
   1. إعداد تركيزات مخزون المضادات الحيوية المناسبة لسلالات الزائفة الزنجارية التي تحتوي على 100 ملغم/مل من الجنتاميسين و30 ملغم/مل الكاناميسين و10 ملغم/مل من توبرامايسين. قم بإذابة المضادات الحيوية في الماء ، وتعقيمها (0.2 ميكرومتر) ، وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية. قم بتغيير المضادات الحيوية والتركيزات اعتمادا على البكتيريا المدروسة.

2. فحص لوحة البقعة للاستجابة للإجهاد التأكسدي

1. قم بإعداد ثقافات بين عشية وضحاها للسلالات المراد اختبارها. أضف 2 مل من مرق رطل إلى أنبوب اختبار 16 × 150 مم (واحد لكل سلالة) وقم بتلقيحه بمستعمرة واحدة معزولة من كل سلالة. احتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع التهوية على دوار لزراعة الأنسجة في حاضنة الهواء.
2. قم بقياس OD₆₀₀ من الثقافات الليلية. اغسل الثقافات قبل أخذ قراءات OD₆₀₀ للتخلص من البيوميلانين الموجود في وسائل الإعلام.
3. اغسل المزارع عن طريق الطرد المركزي 1 مل من المزرعة في جهاز طرد مركزي دقيق عند 16,000 × جم لمدة دقيقتين. قم بإزالة المادة الطافية وأي خلايا محببة بشكل فضفاض باستخدام ماصة صغيرة ، وأعد تعليق حبيبات الخلية الصلبة في 1 مل رطل.
4. في اليوم التالي ، قم بإعداد ألواح أجار LB التي تحتوي على H₂O₂ كضغط مؤكسد. يعد نطاق تركيزات H₂O₂ من 0 إلى 1 ملي مولار نقطة انطلاق جيدة.
   1. تذوب قوارير أجار LB. قم بتبريد الوسائط إلى حوالي 50 درجة مئوية في درجة حرارة الغرفة.
   2. أضف H₂O₂ مباشرة إلى الوسائط المبردة بالتركيزات المطلوبة. قوارير دوامة للخلط. انظر الجدول 1 للحصول على تركيزات H₂O₂ وأحجام H₂O₂ المركزة لإضافتها. تستند هذه القيم إلى 100 مل من أجار LB.
   3. صب الأطباق مباشرة بعد إضافة H₂O₂ وقم بإشعال السطح لإزالة الفقاعات. العائد 4 أطباق لكل 100 مل من أجار LB. ضع علامة على الألواح بتركيز H₂O₂.
   4. ضع الألواح مكشوفة في غطاء تدفق بيولوجي مع تشغيل المروحة لمدة 30 دقيقة لإزالة الرطوبة الزائدة من الألواح. < / > ملاحظه: استخدم الأطباق في نفس يوم تحضيرها. قد يؤدي عدم القيام بذلك إلى بيانات غير متسقة.
      ملاحظه: يمكن استبدال الضغوطات التأكسدية مثل الباراكوات ب H₂O₂ في هذا الفحص. قد تختلف التركيزات المستخدمة في الضغوطات التأكسدية الأخرى عن تلك المستخدمة في H₂O₂.
5. اغسل وقم بقياس OD₆₀₀ من الثقافات الليلية.
6. تطبيع OD₆₀₀ لجميع الثقافات الليلية إلى أدنى قيمة لمجموعة السلالات التي يتم اختبارها. P. aeruginosa بشكل عام لديه OD₆₀₀ من حوالي 2.5 عندما ينمو بين عشية وضحاها في LB.
   1. تحديد حجم المزرعة اللازمة لتخفيف المزرعة إلى أدنى OD₆₀₀ بحجم إجمالي قدره 1 مل. على سبيل المثال، إذا كانت الثقافة تحتوي على OD₆₀₀ من 3 وأدنى OD₆₀₀ لمجموعة السلالات هو 2.5، فقم بإجراء الحساب التالي: (2.5)(1 مل) = (3)(x). x = 0.833 مل سيتم وضع 0.833 مل من الثقافة في أنبوب ميكروفوج.
   2. احسب كمية LB + DMSO اللازمة لرفع حجم المزرعة إلى 1 مل. على سبيل المثال في الخطوة 4.4.1، ستكون كمية LB + DMSO المضافة إلى المزرعة 0.167 مل (الحجم الإجمالي 1 مل - 0.833 مزرعة مل). اصنع محاليل مخزون LB + DMSO لاستخدامها في هذه التخفيفات بناء على الحجم اللازم لتخفيف جميع السلالات.
   3. امزج الثقافة و LB + DMSO عن طريق الدوامة.
7. للحفاظ على الثقافات في تركيز ثابت من DMSO ، قم بإجراء تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف للثقافات الليلية الطبيعية في PBS + DMSO.
   1. قم بعمل حل مخزون من PBS + DMSO. بالنسبة لمجموعة واحدة من التخفيفات لسلالة واحدة ، امزج حجم 300 ميكرومتر من DMSO مع PBS للحصول على حجم إجمالي قدره 720 ميكرولتر. قم بتوسيع نطاق هذه المخزونات لأعلى أو لأسفل اعتمادا على عدد السلالات التي تم اختبارها.
   2. قم بتسمية أنابيب الطرد الدقيق ل ^10-1 إلى ^10-7 تخفيفات تسلسلية. أضف 90 ميكرولتر من PBS + DMSO إلى الأنابيب المناسبة. استخدم PBS + DMSO للسلالات المزروعة في LB + DMSO.
   3. أضف 10 ميكرولتر من الثقافة إلى أنبوب التخفيف المناسب ^10-1. امزج عن طريق الدوامة وانقل 10 ميكرولتر من التخفيف ^10-1 إلى أنبوب التخفيف ^10-2. كرر حتى يتم إجراء جميع التخفيفات. قم بتغيير أطراف الماصات بين التخفيفات.
8. بقعة 5 ميكرولتر من ^10-3 إلى ^10-7 تخفيفات على ألواح LB + H₂O₂ في نسخ لكل سلالة. استخدم طرف ماصة واحدا إذا كانت البقع مطلية من الأكثر تمييعا إلى الأقل تمييعا (^10-7 إلى ^10-3). لا تقلب اللوحة أو تميل حتى يجف السائل في الطبق.
9. احتضان الألواح لمدة 24-48 ساعة عند 37 درجة مئوية (حاضنة الهواء) ، اعتمادا على السلالة.
   ملاحظة: P. aeruginosa PAO1 سيكون لها مستعمرات جيدة الحجم على LB بعد 24 ساعة من الحضانة. احتضان السلالات حتى يكون لها مستعمرات بنفس حجم PAO1 تقريبا.
10. قم بتصوير اللوحات باستخدام كاميرا CCD فوق جهاز المضيء. اختياريا ، قم بتحرير الصور للتباين واقتصاصها بنفس الحجم. احسب عدد المستعمرات في كل بقعة لتحديد التغيرات في الحساسية للإجهاد التأكسدي.

< p class = "jove_content" >الجدول 1: تركيزات H₂O₂ لإضافتها إلى LB أجار لفحص لوحة بقعة الإجهاد التأكسدي. يعطي هذا الجدول تركيزات H₂O₂ المختلفة والكمية المقابلة من مخزون H₂O₂ المركز لإضافته إلى 100 مل رطل أجار.

التركيز النهائي ل H₂O₂ (مليمتر) كمية 9.79 M H₂O₂ (30٪ بالوزن) لإضافة (μl) 0 0 0.2 2.04 دولار 0.4 4.09 0.6 6.13 [إ] 0.8 8.17 [إ] 1 10.21

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2- [2-نيترو-4- (ثلاثي فلوروميثيل) بنزويل] -1،3-سيكلوهكسانيديون (NTBC) سيجما ألدريتش SML0269-50 ملغ وتسمى أيضا nitisinone. قابل للذوبان في DMSO. ح₂س₂ سيجما ألدريتش 216763-100 مل 30 بالوزن في H2O. استقرت.