Method Article

تقييم فعالية مركب الاختبار ضد البكتيريا الفطرية في المرق

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Zheng، X.، et al. نظام لفحص الفعالية والسمية الخلوية للمثبطات التي تستهدف المتفطرة السلية داخل الخلايا. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو فحصا في المرق لتحديد فعالية المضادات الحيوية ضد المتفطرة السلية. يتم تحضين الثقافة البكتيرية بتركيزات مختلفة من مضاد حيوي مبيد للجراثيم. يتم قياس فعالية مبيد الجراثيم من خلال تقييم وجود بكتيريا قابلة للحياة باستخدام مقايسة ريزازورين.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة < ص = "jove_title" >1. السلالة البكتيرية ووسط النمو

  1. اصنع محلول سكر العنب والملح (ADS) عن طريق إذابة 25 جم من ألبومين مصل الأبقار ، و 10.0 جم من سكر العنب ، و 4.05 جم من كلوريد الصوديوم في 460 مل من الماء منزوع الأيونات. قم بتصفية تعقيم التصويب وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  2. اصنع مرق 7H9 بإضافة 4.7 جم من مسحوق 7H9 و 2 مل من الجلسرين إلى 900 مل من الماء النقي. قم بالتعقيم في مرق 7H9 عند 121 درجة مئوية لمدة 10 دقائق واتركه يبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة. اصنع 7H9ADST بإضافة 100 مل من ADS و 0.5 مل من Tween80 إلى 900 مل من مرق 7H9. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  3. يزن 50 مجم من كبريتات الكاناميسين ويذوب في 1 مل من الماء منزوع الأيونات ؛ التركيز النهائي هو 50 مجم / مل. قم بتصفية التعقيم وتخزينها عند -20 درجة مئوية. أضف 0.5 مل من محلول مخزون الكاناميسين لكل 1 لتر من 7H9ADST.
    ملاحظه: يجب أن يكون هذا الوسيط طازجا ، لذا قم بقياس الأحجام بشكل مناسب وفقا لحجم المزرعة.
  4. ينمو مرض السل في 7H9ADST مكمل بالكاناميسين في الثقافة الدائمة. هز المزرعة يوميا وقم بتخفيفها قبل أن يصل OD600 إلى 1.0 لتجنب التكتل.
    ملاحظه: كانت سلالة السل المستخدمة لتطوير هذه الطريقة هي H37Rv التي تم تحويلها باستخدام بلازميد pJAK2.A. pJAK2.A هو بلازميد تكاملي يعتمد على ناقل pMV361 ، والذي يسمح بالتعبير عالي المستوى عن جين اليراع لوسيفيراز من محفز hsp60 ويمكن اختياره باستخدام الكاناميسين.

2. تحليل النشاط داخل المرق باستخدام اختبار Resazurin

  1. تنمو M. السل في 7H9ADST إلى مرحلة منتصف السجل (~ 0.5 - 0.8 OD600). قم بتخفيف الثقافة باستخدام 7H9ADST إلى 0.01 OD600. قم بتخفيف المركبات في 7H9ADST إلى 2x تركيزات الاختبار وتناول 100 ميكرولتر من كل مركب مخفف في كل بئر.
  2. انقل 100 ميكرولتر من المعلق البكتيري المخفف إلى كل بئر. اترك الألواح تحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة لمدة 5 أيام. قم بإذابة 10 مجم من الريزازورين في 100 مل من الماء منزوع الأيونات وفلتر معقم.
  3. أضف 30 ميكرولتر من محلول الريزازورين وراقب تغير اللون بعد 48 ساعة ؛ يشار إلى نمو البكتيريا من خلال تحويل اللون من الأزرق إلى الورد><ي. ملاحظه: يمكن أيضا إجراء تحليل كمي عن طريق قياس التألق عند 590 نانومتر مع الإثارة عند 530-560 نانومتر أو الامتصاص عند 570 نانومتر و 600 نانومتر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments ميدلبروك 7H9 بيكتون وديكنسون وشركاه هاتف: 271210 توين80 فيشر ساينتيك تي 164 الألبومين ، الرقم الهيدروجيني البقري 7 أفيميتريكس هاتف 10857 سكر العنب فيشر ساينتيك بي ت 350 كلوريد الصوديوم فيشر ساينتيك ص358 كبريتات الكاناميسين فيشر ساينتيك بي ت 906 ريزازورين ألفا إيسار ب 21187 الجلسرين فيشر ساينتيك بي إب 229 M. السل H37Rv 96 بئر صفيحة بيضاء مسطحة القاع كورنينج 3917 95 بئر صفيحة شفافة القاع المسطح كورنينج 3595 لوحة شفافة السدادة ثيرمو فيشر العلمي AB-0580 مقياس الإضاءة الأنظمة الحيوية التطبيقية تروبيكس: TR717

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mycobacterium tuberculosisTest CompoundResazurin AssayFluorescence Plate ReaderSerial DilutionsBacterial GrowthCytotoxic Effects7H9ADST MediumIncubation ProtocolViable Bacteria

Related Articles