قياس TEER في الخلايا الظهارية المشعة بالأشعة السينية المزروعة بالاشتراك مع PBMCs

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Babini ، G. ، et al. طريقة زراعة مشتركة للتحقيق في الحديث المتبادل بين خلايا Caco-2 المشعة بالأشعة السينية و PBMC. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة في خلايا Caco-2 المشععة ، سواء في وجود خلايا PBMC أو غيابها. تتيح هذه الطريقة دراسة التأثيرات التآزرية للإشعاع والخلايا المناعية على حاجز الخلية الظهارية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إعداد التشعيع

ملاحظة: تم إجراء تشعيع خلايا Caco-2 في قسم العلاج الإشعاعي في Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (بافيا ، إيطاليا) باستخدام مسرع خطي يستخدم بشكل روتيني لعلاج أنواع مختلفة من السرطانات.

1. اضبط طاقة الأشعة السينية الفوتونية على ذروة 6 ميجافولت. يعمل المسرع الخطي في نظام نابض (الوقت بين نبضتين متتاليتين حوالي 4 مللي ثانية ؛ مدة نبضة واحدة حوالي 5 ميكرو ثانية بمعدل جرعة يصل إلى 1 × ^10-3 gy / p).
2. ضع الألواح المكونة من 6 آبار التي تحتوي على إدخالات مع Caco-2 على مسار الأشعة السينية على ورقة زجاجية بسمك 1.4 سم (تتوافق مع مسافة أكبر قليلا من تراكم الإشعاع المستخدم) على بعد 100 سم من مصدر الإشعاع.
3. ضع بلعة بسمك 0.5 سم على كل عينة قبل حدوث التشعيع لضمان مكون الإشعاع المتناثر وتوازن الجسيمات المشحونة.
4. تشعيع الخلايا (جرعات في النطاق 2 - 10 غراي) بمجال إشعاع مسطح ومتماثل (± 2٪) 20 × 20 سم₂ ومعدل جرعة 3 جاي / دقيقة < br / > ملاحظه: خضعت الخلايا المشعة "الوهمية" للتحكم نفس الظروف الإجرائية للخلايا المشعة ، دون دخول غرفة التشعيع (الجرعة المستلمة: 0 Gy).
   أنذر: يجب استخدام الأجهزة المنتجة للإشعاع المؤين فقط من قبل موظفين متخصصين.

فئة

2. المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER)

1. البذور 5 × 10⁵ خلايا Caco-2 قبل أسبوع واحد من التشعيع في إدخالات الزراعة المشتركة ذات 6 آبار (البولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) ، 2 × 10⁶ مسام / سم 2).
2. قبل 1 ساعة من التشعيع ، قم بقياس TEER باستخدام الفولتميتر / الأومتر.
3. تشعيع الخلايا كما هو موضح في الخطوات 1.1 - 1.4.
4. احتضان خلايا Caco-2 في وجود / عدم وجود زراعة مشتركة مع PBMC عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO₂.
5. في الساعات القليلة الأولى بعد التشعيع ، قم بقياس TEER كل ساعة ، وبعد ذلك كل 3 ساعات حتى 48 ساعة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات إدراج ثقافة خلايا الآبار ThinCert 6 لألواح متعددة الآبار غرينر بيو ون 657610 معدات لوحة ثقافة الخلية متعددة الآبار ، 6 بئر غرينر بيو ون 657160 بلاستيك لوحة ثقافة الخلية متعددة الآبار ، 24 بئر غرينر بيو ون 662160 [م] بلاستيك RPMI 1640 بدون L-Glutamine لونزا 12-167 فهرنهايت الكواشف الفولتميتر / أوميتر Millicell-ERS ميليبور 00001 معدات