اختبار الأغشية الحيوية للوحة الوتد لفحص العوامل المضادة للبكتيريا

الملخص

المصدر: Dalecki ، A. G. ، et al. استهداف المكورات العنقودية الذهبية المرتبطة بالغشاء الحيوي باستخدام مقايسة الحساسية للأدوية القائمة على Resazurin. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو فحصا لفحص المركبات المضادة للميكروبات التي تقضي بكفاءة على الأغشية الحيوية باستخدام لوحة التوتد. تراقب المنهجية حالة التمثيل الغذائي للأغشية الحيوية بعد العلاج بالمركبات المضادة للميكروبات ، مما يسهل تحديد الحد الأدنى لتركيز استئصال الأغشية الحيوية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. بدء الفيلم الحيوي

1. قم بزراعة ثقافة الكائنات الحية المنتجة للأغشية الحيوية في وسط غني بالمغذيات. تلقيح المكورات العنقودية الذهبية سلالة نيومان في 10 مل من وسط مولر هينتون من مخزون الجلسرين. قم بأداء جميع الأعمال التي تنطوي على التعامل مع المكورات العنقودية الذهبية بالقفازات وداخل خزانة السلامة الحيوية.
2. احتضن لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية على شاكر دوار (100-200 دورة في الدقيقة).
3. حدد OD₆₀₀ للثقافة باستخدام مقياس الطيف الضوئي وكوفيت قياسي (طول المسار: 1 سم).
4. احسب حجم (V) من المزرعة اللازمة لتحضير 20 مل من اللقاح باستخدام OD_{600 (لقاح)} 0.1 في وسائط معهد روزويل بارك التذكاري (CRPMI) باستخدام الصيغة: [V = 20 مل * 0.1 / OD_{600 (ثقافة)}].
   1. أضف حجم الثقافة المحسوب (من الأعلى) إلى أنبوب الطرد المركزي وخلايا الحبيبات عن طريق الدوران لمدة دقيقة واحدة عند 10,000 × جم. لتحضير لقاح الأغشية الحيوية ، قم بشفط وسط النمو المستهلك وأعد تعليق حبيبات الخلية في 20 مل CRPMI.
5. صب اللقاح في خزان 25 مل.
6. قم بإزالة الغطاء بعناية من لوحة ربط معقمة مكونة من 96 بئرا عن طريق سحبها بشكل مستقيم لأعلى.
   ملاحظة: يجب الحرص على عدم تلويث الأوتاد المتدلية من الغطاء. يمكن وضع الغطاء رأسا على عقب على سطح نظيف داخل خزانة السلامة الحيوية.
7. باستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 200 ميكرولتر، أضف 125 ميكرولتر لقاح إلى كل بئر من الصفوف من A إلى G من اللوحة السفلية.
8. املأ 125 ميكرولتر من وسط CRPMI المعقم في كل بئر من الصف H كعنصر تحكم في العقم.
9. خذ غطاء الوتد واحتفظ به فوق قاع اللوحة بحيث تكون الأوتاد متجهة لأسفل. قم بمحاذاة الأوتاد الفردية بعناية مع الآبار الخاصة بها. تجنب الاتصال الجسدي بين اللوحة والأوتاد. بمجرد محاذاة الغطاء ، اخفض الغطاء بعناية لأسفل. تجنب المحاذاة الخاطئة لأن عمليات إعادة الضبط التي يتم إجراؤها بعد لمس الأوتاد للوحة السفلية قد تلوث عناصر التحكم في العقم في الصف H.
10. أغلق غطاء اللوحة بغشاء البارافين لمنع التبخر وضعه في كيس بلاستيكي قابل للغلق ، وأغلقه بإحكام. حافظ على حجم الهواء في الكيس منخفضا قدر الإمكان لتقليل التبخر.
11. احتضان دون اهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_بنسبة 5٪.
    ملاحظة: كانت 48 ساعة من النمو مثالية للمكورات العنقودية الذهبية ، ولكنها ستختلف بناء على الكائن الحي المستخدم.
    ملاحظه: على الرغم من أن الحضانة الساكنة هي نقطة انطلاق جيدة لتحسين الفحص ، إلا أن الاهتزاز برفق عند 150 دورة في الدقيقة على شاكر صفيحة دقيقة هو اختلاف محتمل قد يعزز تكوين الأغشية الحيوية لبعض عزلات المكورات العنقودية الذهبية.

< p class = "jove_title" >2. تحضير لوحة تحدي Biofilm

1. في يوم تحدي الأغشية الحيوية ، خذ صفيحة جديدة مكونة من 96 بئرا وأضف 100 ميكرولتر من CRPMI ، موازنة ل RT ، إلى كل بئر من الصفوف من B إلى H. لتجنب النتائج غير المتسقة ، استخدم صفيحة مكونة من 96 بئرا يمكنها استيعاب 200 ميكرولتر من الوسائط عندما تكون الأوتاد بالداخل ، وتتميز بآبار ذات أبعاد مماثلة لتلك الموجودة في لوحة بدء الأغشية الحيوية.
2. يخفف ما يصل إلى 4 مركبات اختبار بشكل منفصل في 1.0 مل من CRPMI إلى 2 أضعاف التركيز النهائي المطلوب، من أجل حساب التخفيف النهائي في الخطوة 2.7.
   ملاحظة: نقطة البداية الجيدة هي 8 أضعاف فوق التركيز المثبط للخلايا العوالق.
3. أضف 200 ميكرولتر من المركب 1 في الآبار A1 إلى A3 ، والمركب 2 في الآبار A4 إلى A6 ، والمركب 3 في الآبار A7 إلى A9 ، والمركب 4 في الآبار A10 إلى A12.
4. قم بتخفيف مركبات الاختبار بشكل متسلسل باستخدام ماصة متعددة القنوات ونقل 100 ميكرولتر من الصف A إلى الصف B وخلطها.
5. بهذه الطريقة ، استمر في نقل 100 ميكرولتر جيدا إلى البئر. امزج بعد كل نقل وتوقف في الصف F.
6. بعد الخلط ، طرد 100 ميكرولتر من الصف F في حاوية النفايات. لا تنقل أي سائل إلى الصفين G و H.
7. أضف 100 ميكرولتر من CRPMI إلى كل بئر من اللوحة باستخدام ماصة متعددة القنوات لرفع الحجم إلى 200 ميكرولتر. انظر الشكل 1 للاطلاع على تخطيط اللوحة النهائي.

< p class = "jove_title" >3. تحدي الفيلم الحيوي

1. أضف 200 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) إلى صفيحة معقمة جديدة مكونة من 96 بئرا تتميز بآبار بأبعاد مماثلة لتلك الموجودة في لوحة بدء الأغشية الحيوية.
2. قم بإزالة الكيس البلاستيكي وفيلم البارافين من لوحة بدء الأغشية الحيوية المحتضنة.
3. ارفع الغطاء بشكل مستقيم لأعلى. تجنب ملامسة الأوتاد وقاع اللوحة لأن ذلك قد يؤدي إلى إتلاف الأغشية الحيوية. احتفظ بالجزء السفلي لتحليل OD₆₀₀ اللاحق (انظر 3.8).
4. اشطف خلايا العوالق عن طريق وضع غطاء الوتد على اللوحة التي تحتوي على PBS (من الخطوة 3.1). اغمر الأوتاد لمدة 5 ثوان ، وارفع من PBS ، واغمر مرة أخرى ، مع الحرص على عدم الاصطدام بالأوتاد على جوانب البئر.
5. ضع غطاء الوتد المغسول في لوحة التحدي. تجنب التلامس غير الضروري بين الأوتاد واللوحة السفلية لأن ذلك سيؤدي إلى إتلاف الأغشية الحيوية مما يؤدي إلى نتائج غير متسقة.
6. أغلق اللوحة بغشاء البارافين وضعها في كيس بلاستيكي قابل للغلق كما هو موضح في الخطوة 1.10.
7. احتضان اللوحة دون اهتزاز لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO₂.
8. خذ الجزء السفلي من لوحة بدء الأغشية الحيوية من 3.3. أعد تعليق البكتيريا في كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات وقم بقياس OD₆₀₀ باستخدام قارئ صفيحة دقيقة مناسب لتأكيد النمو الذي يحدث في جميع الآبار باستثناء ضوابط العقم في الصف H.

فئة

4. تحديد الأغشية الحيوية

1. استخدم قارئ لوحة مزودا بغرفة حضانة وقادر على أخذ قراءات مضان حركية للكشف عن تحويل الريزازورين. قم بإعداد قياس مضان حركي على مدار 24 ساعة باستخدام إثارة 530 نانومتر وانبعاث 590 نانومتر.
2. اضبط درجة حرارة الغرفة على 37 درجة مئوية واجعل اللوحة تقرأ كل 20 دقيقة. اضبط قارئ اللوحة للقياس من أسفل اللوحة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
3. قم بإعداد لوح الغسيل عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من PBS مع ماصة متعددة القنوات إلى صفيحة معقمة سعة 96 بئرا.
4. تحضير وسيط استعادة الأغشية الحيوية عن طريق إضافة 400 ميكرولتر من محلول مخزون الريزازورين 0.8 مجم / مل إلى 20 مل من وسط CRPMI إلى تركيز نهائي يبلغ 16 ميكروغرام / مل ريزازورين.
   ملاحظه: ريزازورين هو مهيج معروف للجلد. استخدم معطف المختبر ونظارات واقية وقفازات أثناء المناولة. تم استخدام CRPMI كوسائط استعادة الأغشية الحيوية لأنها توفر أقل إشارة خلفية ، ولكن يمكن استبدالها بوسائط مولر هينتون إذا كان ذلك مناسبا.
5. أضف 150 ميكرولتر من وسط استرداد الأغشية الحيوية مع ماصة متعددة القنوات إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا جديدة.
6. انقل لوحة التحدي من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية وقم بإزالة الكيس البلاستيكي وفيلم الختم بعناية.
7. قم بإزالة غطاء الوتد من لوحة التحدي واشطف الخلايا العوالق في PBS كما هو موضح في 3.4. احتفظ بالجزء السفلي من لوحة التحدي لتحليل OD₆₀₀ اللاحق (انظر 4.10).
8. بعد الشطف ، ضع غطاء الوتد في قاع اللوحة الذي يحتوي على وسط استعادة الأغشية الحيوية.
9. لف جانب اللوحة بغشاء البارافين ، مع الحرص على عدم إعاقة قاع الآبار المحيطة. مباشرة بعد لف اللوحة ، ضعها على قارئ اللوحة وابدأ قراءة حركية على مدار 24 ساعة عن طريق بدء بروتوكول ريزازورين الحركي الذي تم إنشاؤه مسبقا من الخطوة 4.1.
10. لتحديد نمو الخلايا العوالق التي قد تحدث أو لا تحدث أثناء التحدي ، اقرأ OD₆₀₀ لقاع لوحة التحدي بالكامل باستخدام قارئ صفيحة دقيقة. اتبع التعليمات الواردة في الخطوة 3.8.
    ملاحظة: أعد تعليق محتوى كل بئر بعناية حيث تميل الخلايا التي تتساقط من الأغشية الحيوية إلى النمو في كتل في قاع البئر. أي فقاعات داخل البئر سوف تتداخل بشدة مع قراءات OD₆₀₀ ويجب تجنبها أو إزالتها قبل القراءة.

النتائج

الشكل 1. تخطيط لوحة التحدي. مثال على تخطيط لوحة التحدي التي تستوعب الاختبار المتوازي لأربعة مركبات في ثلاث نسخ بستة تركيزات متميزة. يتم أيضا تضمين ضوابط العقم غير المعالجة. يدعم تصميم التصميم الإعداد المريح داخل اللوحة للتخفيفات التسلسلية باستخدام ماصة متعددة القنوات. التركيزات بالميكرومتر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مولر هينتون وسط أوكسويد سم 0405 اتبع توصيات الشركة المصنعة RPMI-متوسط كورنينج 17-105-السيرة الذاتية CRPMI المرجع 9 RPMI-1640 متوسط الحجم لمدة ساعة واحدة مع راتنج Chelex 100 ثم يتم استكماله بنسبة 10٪ unchelexed RPMI-1640 شيلكس 100 راتنج بيو راد 142-2822 لوحات MBEC Innovotech 19111 ريزازورين ملح الصوديوم سيغما R7017 800 ميكروغرام / مل في فلتر مياه DI معقم منصة اهتزاز اللوحة الصغيرة هايدولف تيتراماكس 1000 قارئ لوحة Cytation 3 بيوتيك برنامج Gen5 بيوتيك تسجيل وتحليل تحويل الريزازورين نيوكوبروين سيغما [ن1501] تحضير 10 ملي من المخزون في 100٪ إيثانول ، وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية كبريتات النحاس أكروس أورجانكس 7758-99-8 تحضير محلول مخزون 100 مم في الماء ، وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية النحاس نيوكوبروين عصامي يتم إنشاؤه عن طريق خلط مولاريات متساوية من النيوكوبروين وكبريتات النحاس. تم تخفيف المزيج في وسط CRPMI إلى التركيز المطلوب. الجنتاميسين سيغما G3632-1G