اختبار قائم على التألق في المختبر لقياس كفاءة إعادة ختم غشاء البلازما

الملخص

المصدر: Lam، J. G.، et al. قياس عالي الإنتاجية لكفاءة إعادة ختم غشاء البلازما في خلايا الثدييات. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو فحصا لدراسة كفاءة إعادة ختم غشاء البلازما في خلايا الثدييات. تتعرض الخلايا لسم بكتيري مكون للمسام ، والذي يشكل مساما في غشاء الخلية. في حالة وجود أيونات الكالسيوم خارج الخلية ، تتسبب المسام في تدفق الكالسيوم ، مما يؤدي إلى أحداث إعادة إغلاق الغشاء. يتم تقييم كفاءة إعادة الختم باستخدام صبغة يوديد البروبيديوم المرتبطة بالحمض النووي ، والتي تدخل الخلايا فقط بدون غشاء معاد إغلاقه.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. التحضير

1. طلاء الخلية
   ملاحظه: تم استخدام الخلايا الظهارية العنقية البشرية ، HeLa و HeLa التي تعبر عن Histone 2B-GFP (H2B-GFP) ، في هذا البروتوكول ، ولكن يمكن تكييف هذا الاختبار مع خلايا الثدييات الأخرى.
   1. افصل الخلايا الملتصقة عن قارورة ثقافة خلية مقاس 75 سم² عن طريق غسل الخلايا ب 2 مل من Trypsin-EDTA 0.25٪. استبدل التربسين المستخدم ب 2 مل من التربسين الطازج EDTA 0.25٪.
   2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق حتى يتم تقريب الخلايا وفصلها عن القارورة.
   3. أعد تعليق الخلايا في 8 مل من وسط النمو (DMEM يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني معطل بالحرارة ، و 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين).
   4. حدد تركيز الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم و 10 ميكرولتر من تعليق الخلية.
   5. تمييع الخلايا في وسط نمو إلى تركيز 2.5 × 10⁵ خلايا / مل.
   6. صب معلق الخلية في حوض ماصة معقم واخلط المعلق جيدا باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل.
   7. باستخدام ماصة دقيقة متعددة القنوات 12 وأطراف سعة 200 ميكرولتر ، قم بتوزيع خلايا HeLa (2.5 × 10⁴ خلايا / 100 ميكرولتر / بئر) في ثلاث نسخ (أو رباعي) في صفيحة مسطحة وشفافة من 96 بئرا ومعالجة أنسجة البوليسترين السوداء المزرو><عة. ملاحظه: يتم تقديم ترتيب الطلاء كمثال في الشكل 1.
   8. استزراع الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. تحضير محلول المخزون
   1. قم بإعداد 1 لتر من مخزون 10x من المخزن المؤقت M (يستخدم لتحضير M1 و M2) عن طريق إضافة 95 جم من محلول الملح المتوازن Hanks ، و 0.476 جم من MgCl₂ (5 مل) ، و 23.83 جم من HEPES (100 مل) إلى 900 مل من الماء. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 وارفع مستوى الصوت إلى 1 لتر. تعقيم الفلتر.
   2. قم بإعداد 50 مل من مخزون الجلوكوز 50x (1.25 M) عن طريق إضافة 11.26 جم من D- (+) -Glucose إلى إجمالي 50 مل من الماء. تصفية تعقيم المحلول.
   3. قم بإعداد 50 مل من مخزون الكالسيوم 100x (120 ملم) عن طريق إضافة 0.666 جم من CaCl₂ إلى ما مجموعه 50 مل من الماء. تصفية تعقيم المحلول.
   4. قم بإعداد 50 مل من مخزون 10x (50 ملم) من الإيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N '، N '، N '، حمض رباعي الأسيتيك (EGTA) عن طريق إضافة 0.951 جم من EGTA إلى 40 مل من الماء. قم بزيادة الرقم الهيدروجيني إلى 8 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم لإذابة EGTA ، ثم ارفع الحجم إلى 50 مل. تصفية تعقيم المحلول.
   5. بالنسبة للوحة واحدة مكونة من 96 بئرا ، قم بإعداد 50 مل من Medium 1 (M1 ، تحتوي على Ca²⁺) ، و 50 مل من Medium 2 (M2 ، Ca^{2 +} - مجاني) ، و 15 مل من Medium 2 مكملة ب EGTA ، وفقا لذلك:
      1. بالنسبة إلى M1 ، أضف 5 مل من 10x Buffer M ، و 0.5 مل من 100x CaCl₂ ، و 1 مل من 50x glucose إلى 43.5 مل من الماء.
      2. بالنسبة إلى M2 ، أضف 5 مل من 10x Buffer M و 1 مل من 50x glucose إلى 44 مل من الماء.
      3. بالنسبة إلى M2 / EGTA ، أضف 1.5 مل من 10x Buffer M و 1.5 مل من 10x EGTA إلى 12 مل من الماء.
         ملاحظه: يجب تحضير جميع المحاليل التي تحتوي على يوديد البروبيديوم (PI) مباشرة قبل إضافتها إلى الخلايا.
3. إعدادات قارئ اللوحة / مقياس التصوير
   ملاحظه: استخدم قارئ لوحة متعدد الأوضاع مزود بوحدتي كشف: مقياس الطيف الفلوري ومقياس التصوير. قلل من التعرض للفلورة لتجنب التبييض الضوئي للفلوروفورات.
   1. قم بتسخين قارئ اللوحة مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل إجراء الفحص.
   2. قم بإعداد معلمات الفحص الحركي وفقا لذلك داخل وضع الإعدادات:
      1. اختر أحادي اللون و FL (تألق) و Kinetic للتكوين البصري وأوضاع القراءة ونوع القراءة ، على التوالي.
      2. ضمن إعدادات الطول الموجي، حدد ممر نطاق الإثارة والانبعاث 9 و 15 نانومتر على التوالي. بالنسبة للمقايسات باستخدام يوديد البروبيديوم (PI) ، اضبط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث على 535 و 617 نانومتر على التوالي.
      3. ضمن نوع اللوحة ، حدد 96 بئرا لتنسيق اللوحة وتكوين لوحة محدد مسبقا يتوافق مع لوحة سفلية شفافة ذات جدار أسود.
      4. ضمن منطقة القراءة ، قم بتمييز الآبار التي سيتم تحليلها في جميع أنحاء الحركية.
      5. ضمن PMT والبصريات، قم بتعيين الفلاشات مسبقا لكل قراءة إلى 6 وحدد المربع للقراءة من الأسفل.
      6. ضمن التوقيت، أدخل 00:30:00 في مربع إجمالي وقت التشغيل لمقايسة حركية مدتها 30 دقيقة، وأدخل 00:05:00 للفاصل الزمني.
         ملاحظة: لكل نقطة زمنية وطول موجي واحد ، فإن زمن قراءة صفيحة كاملة مكونة من 96 بئرا هو 30 ثانية.
      7. قم بتأكيد الإعدادات المحددة في معلومات الإعدادات على اليمين وحدد موافق. اضغط على قراءة لبدء التشغيل الحركي.
   3. قم بإعداد معلمات التصوير وفقا لذلك في وضع الإعدادات:
      1. اختر Minimax وImaging وEndpoint للتكوين البصري وأوضاع القراءة ونوع القراءة على التوالي.
      2. ضمن الأطوال الموجية ، حدد الضوء المرسل ، وإما أو كليهما الصندوقين الفلوريين المقابلين للأطوال الموجية للإثارة والانبعاث البالغة 456/541 نانومتر (GFP) و 625/713 نانومتر (PI).
      3. استخدم نفس الخيارات لنوع اللوحة ومنطقة القراءة كما هو محدد في الخطوتين 1.3.2.3 و 1.3.2.4.
      4. ضمن إعداد منطقة البئر ، حدد عدد المواقع داخل البئر المراد تصويرها.
         ملاحظة: 12 موقعا تتوافق مع صورة البئر الكاملة.
      5. ضمن إعدادات الحصول على الصور، حدد أوقات التعريض الضوئي للضوء المرسل، 541 (GFP)، و713 (PI). بالنسبة إلى GFP ، قم بتصوير البئر بأكمله بوقت تعرض يبلغ 20 مللي ثانية / صورة. بالنسبة للضوء المرسل (TL) و PI الفلور ، احصل على صورة واحدة لمركز كل بئر بزمن تعرض يبلغ 8 و 20 مللي ثانية ، على التوالي.
      6. قم بتأكيد الإعدادات المحددة في معلومات الإعدادات على اليمين وحدد موافق. وقت الاستحواذ لتصوير السطح الكامل لكل بئر (12 صورة / بئر) لصفيحة ذات 96 بئرا ولطول موجي واحد هو ~ 15 دقيقة. اضغط على قراءة لبدء التصوير.
         ملاحظة: يتطلب وقت الحصول على صورة / بئر واحد للوحة ذات 96 بئرا ~ 2.5 دقيقة / لوحة لطول موجي واحد. تتوافق المعلمات الموضحة أعلاه مع المعدات المحددة في مختبرنا. قياسات قياس الطيف الفلوري: مصباح فلاش زينون يعرض أطوال موجية للإثارة بمقدار 1.0 نانومتر (250-850 نانومتر) مع ممر نطاق قابل للتعديل 9 أو 15 نانومتر ، وكاشف أنبوب مضاعف ضوئي بنطاق ديناميكي > 6 لوغاريتم ، وتمرير نطاق انبعاث قابل للتعديل 15 أو 25 نانومتر. مقياس التصوير: مصدر ضوء إضاءة قادر على الضوء الأبيض ، 460 نانومتر ، و 625 نانومتر أطوال موجية للإثارة مع ممر نطاق 20 نانومتر ، ومرشحات انبعاث متمركزة عند 541 نانومتر (ممر نطاق 108 نانومتر) و 713 نانومتر (ممر نطاق 123 نانومتر) ، على التوالي ، وهدف 4X مقترن بكاميرا جهاز مقترنة بالشحن بدقة 1.25 ميجابكسل 12 بت.

< p class = "jove_title" >2. الفحص

ملاحظة: في وقت الفحص ، يجب أن تكون الخلايا متقاربة بنسبة 70-90٪. أثناء خطوات الغسيل ، يجب إزالة الوسيط وتطبيقه على الجدار الجانبي للبئر (وليس فوق الخلايا مباشرة). حافظ على درجة حرارة LLO عند < 4 درجات مئوية لمنع تجميعها حتى الخطوة 3.1.5.

1. قم بإعداد مخزون من 30 ميكرومتر PI في M1 ومخزون من 30 ميكرومتر PI في M2 تم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية.
2. اغسل الخلايا برفق في اللوحة 1 باستخدام ماصة دقيقة متعددة القنوات ذات 12 قناة وأطراف 200 ميكرولتر، على النحو التالي:
   1. للظروف المسموح بها ، قم بإزالة وسط النمو وغسل الخلايا مرتين باستخدام 200 ميكرولتر / بئر M1 دافئ مسبقا عند 37 درجة مئوية. استبدل الوسط ب 100 ميكرولتر / بئر من M1 الدافئ الذي يحتوي على 30 ميكرومتر PI.
   2. لظروف الإصلاح المقيدة ، قم بإزالة وسط النمو وغسل الخلايا مرة واحدة ب 200 ميكرولتر / دافئ جيدا M2 يحتوي على 5 ملي مولار EGTA لاستخلاص Ca²⁺ ، متبوعا بغسل واحد ب 200 ميكرولتر / بئر M2. استبدل الوسط ب 100 ميكرولتر / M2 دافئ جيدا يحتوي على 30 ميكرومتر PI.
   3. بعد غسل وسط النمو واستبداله بوسط يحتوي على يوديد البروبيديوم ، انتقل مباشرة إلى الخطوة 2.1.3.
3. لوحة الصورة 1 تحت الضوء المرسل و GFP و PI كما هو مفصل في 1.3.3 (ما قبل الحركة). تستغرق هذه الخطوة 15-20 دقيقة.
4. خلال فترة ال 15 دقيقة في الخطوة 2.1.3، قم بإعداد اللوحة 2 باستخدام ماصة دقيقة متعددة القنوات 12 وأطراف 200 ميكرولتر على النحو التالي:
   1. ضع صفيحة بولي بروبلين مستديرة القاع 96 بئرا على الثلج. قم بتكوين اللوحة باستخدام تصميم تجريبي يتوافق مع اللوحة 1 (الشكل 1).
   2. بالنسبة للظروف المسموح بها ، أضف 100 ميكرولتر / بئر من M1 المثلج البارد الذي يحتوي على 60 ميكرومتر PI ، متبوعا بإضافة 100 ميكرولتر / بئر من M1 المثلج البارد الذي يحتوي على 4x LLO أو لا للتحكم
   3. بالنسبة للظروف المقيدة للإصلاح ، أضف 100 ميكرولتر / بئر من M2 المثلج البارد الذي يحتوي على 60 ميكرومتر PI ، متبوعا بإضافة 100 ميكرولتر / بئر من M2 المثلج البارد الذي يحتوي على 4x LLO أو لا للتحكم
5. بعد تصوير اللوحة 1 (الخطوة 2.1.3) ، ضعها على الفور على الجليد ، باستخدام رقائق الألومنيوم لفصل اللوحة عن التلامس المباشر مع الجليد. اترك الطبق 1 ليبرد لمدة 5 دقائق.
6. باستخدام ماصة دقيقة متعددة القنوات 12 وأطراف سعة 200 ميكرولتر، انقل 100 ميكرولتر من كل بئر إلى الصفيحة 2 (الخطوة 2.1.4) إلى الآبار المقابلة في اللوحة 1. لتوزيع السم بشكل صحيح في وسائط اللوحة 1 ، أدخل الأطراف الموجودة أسفل الغضروف المفصلي وأخرج الحجم برفق دون إدخال فقاعات.
   ملاحظة: لا تقم بسحب الماصة لأعلى ولأسفل ، لأن ذلك قد يؤدي إلى فصل الخلايا عن غير قصد.
7. اترك اللوحة لمدة 1 دقيقة إضافية للسماح للسم بالارتباط بالخلايا وانقل اللوحة 1 على الفور إلى قارئ اللوحة للفحص الحركي باستخدام وضع مقياس الطيف الفلوري (الخطوة 1.3.2).
8. في نهاية الفحص الحركي ، قم على الفور بتصوير اللوحة 1 (ما بعد الحركية) باستخدام الخطوة 1.3.3.

< p class = "jove_title" >3. التحليل: تعداد الخلايا

1. حدد عدد الخلايا بناء على التألق النووي باستخدام برنامج تعداد الخلايا الدقيقة.
   1. ضمن الإعدادات، حدد إعادة التحليل، وضمن قسم الفئة ضمن إعدادات تحليل الصور، حدد تحليل الكائن السري باستخدام 541 كطول موجي للعثور على الكائنات.
   2. ضمن خيار البحث عن الكائنات ، باستخدام طريقة البحث عن الرسم على الصور ، حدد النوى ضمن علامة تبويب الإعدادات ، واضغط على تطبيق.
   3. اضغط على موافق وقراءة لبدء خوارزمية عد الخلايا.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: التصميم التجريبي. يصور مخطط التدفق تصميما تمثيليا للوحة تم تكوينه لاختبار تأثير سبعة ظروف اختبار مقارنة بالخلايا الضابطة غير المعالجة. وينبغي إدراج ضوابط إضافية عند الاقتضاء، مثل مركبات المخدرات. يتم طلاء الخلايا (اللوحة 1) قبل 24 ساعة من التجربة. في يوم التجربة ، يتم غسل الخلايا الموجودة في اللوحة 1 بوسط M1 أو M2 تم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية ، ويتم تصوير اللوحة (TL و GFP و P...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات قارئ الألواح الدقيقة متعدد الأوضاع SpectraMax i3x الأجهزة الجزيئية i3x مقياس الخلايا للتصوير MiniMax 300 الأجهزة الجزيئية 5024062 إلى برو-3 ثيرموفيشر العلمي تي 3605 بروبيديوم يوديد ثيرموفيشر العلمي ص 3566 هيلا ATCC CCL2 هيلا H2B-GFP ميليبور SCC117 تريبسين EDTA 0.25٪ ثيرموفيشر العلمي 25200056 96 بئر Corning مسطحة القاع لوحة معالجة أنسجة البوليسترين الأسود كورنينج 3603 أملاح هانكس المتوازنة سيجما ألدريتش H4891 EGTA ISC BioExpress 0732-100 جرام هيبس فيشر ساينتيك BP310-500 D- (+) - الجلوكوز ، HybriMax سيجما ألدريتش G5146-1 كجم