اختبار قائم على التألق في المختبر لقياس كفاءة إعادة ختم غشاء البلازما

الملخص

المصدر: Lam، J. G.، et al. قياس عالي الإنتاجية لكفاءة إعادة ختم غشاء البلازما في خلايا الثدييات. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو فحصا لدراسة كفاءة إعادة ختم غشاء البلازما في خلايا الثدييات. تتعرض الخلايا لسم بكتيري مكون للمسام ، والذي يشكل مساما في غشاء الخلية. في حالة وجود أيونات الكالسيوم خارج الخلية ، تتسبب المسام في تدفق الكالسيوم ، مما يؤدي إلى أحداث إعادة إغلاق الغشاء. يتم تقييم كفاءة إعادة الختم باستخدام صبغة يوديد البروبيديوم المرتبطة بالحمض النووي ، والتي تدخل الخلايا فقط بدون غشاء معاد إغلاقه.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. التحضير

1. طلاء الخلية
   ملاحظه: تم استخدام الخلايا الظهارية العنقية البشرية ، HeLa و HeLa التي تعبر عن Histone 2B-GFP (H2B-GFP) ، في هذا البروتوكول ، ولكن يمكن تكييف هذا الاختبار مع خلايا الثدييات الأخرى.
   1. افصل الخلايا الملتصقة عن قارورة ثقافة خلية مقاس 75 سم² عن طريق غسل الخلايا ب 2 مل من Trypsin-EDTA 0.25٪. استبدل التربسين المستخدم ب 2 مل من التربسين الطازج EDTA 0.25٪.
   2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق حتى يتم تقريب الخلايا وفصلها عن القارورة.
   3. أعد تعليق الخلايا في 8 مل من وسط النمو (DMEM يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني معطل بالحرارة ، و 100 وحدة / مل بنسلين ....

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: التصميم التجريبي. يصور مخطط التدفق تصميما تمثيليا للوحة تم تكوينه لاختبار تأثير سبعة ظروف اختبار مقارنة بالخلايا الضابطة غير المعالجة. وينبغي إدراج ضوابط إضافية عند الاقتضاء، مثل مركبات المخدرات. يتم طلاء الخلايا (اللوحة 1) قبل 24 ساعة من التجربة. في يوم التجربة ، يتم غسل الخلايا الموجودة في اللوحة 1 بوسط M1 أو M2 تم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية ، ويتم تصوير اللوحة (TL و GFP و P.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات قارئ الألواح الدقيقة متعدد الأوضاع SpectraMax i3x الأجهزة الجزيئية i3x مقياس الخلايا للتصوير MiniMax 300 الأجهزة الجزيئية 5024062 إلى برو-3 ثيرموفيشر العلمي تي 3605 بروبيديوم يوديد ثيرموفيشر العلمي ص 3566 هيلا ATCC CCL2 هيلا H2B-GFP ميليبور SCC117 تريبسين EDTA 0.25٪ ثيرموفيشر العلمي 25200056 96 بئر Corning مسطحة القاع لوحة معالجة أنسجة البوليسترين الأسود كورنينج 3603 أملاح هانكس المتوازنة سيجما ألدريتش H4891 EGTA ISC BioExpress 0732-100 جرام هيبس فيشر ساينتيك BP310-500 D- (+) - الجلوكوز ، HybriMax سيجما ألدريتش G5146-1 كجم