تلطيخ الكيمياء المناعية للكشف عن مستضدات فيروس داء

الملخص

المصدر: Niezgoda ، M. et al. ، اختبار الكيمياء المناعية للكشف عن مستضد فيروس Lyssavirus من الأنسجة الثابتة بالفورمالين. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو تلطيخ الكيمياء النسيجية المناعية للكشف عن مستضد فيروس داء في أنسجة دماغ الفئران المصابة. تشمل العملية إزالة البارافينات والعلاج بالكحول ، يليه العلاج المحلل للبروتين لتعزيز إمكانية الوصول إلى المستضد. يكشف تلطيخ الكيمياء المناعية عن رواسب حمراء ، مما يؤكد وجود مستضدات داء في قسم الأنسجة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< ص الفئة = "jove_title" >1. تثبيت الفورمالين للأنسجة

1. ضع أنسجة المخ 3-5 مم التي تم جمعها بعد التشريح في محلول الفورمالين المخزن بالفوسفات بنسبة 10٪ (نسبة الأنسجة / الفورمالين من 1:20 إلى 1:50) لمدة 24-72 ساعة < / > أنذر: الفورمالين مثبت سام.
2. سجل وزن الأنسجة التقريبي (الحجم) ونوع الأنسجة (مناطق الدماغ) وحجم الفورمالين. من المهم للمختبرات توثيق والاحتفاظ بسجلات في أوقات التثبيت.
3. لتخزين الأنسجة لفترة أطول بعد تثبيت الفورمالين وقبل المعالجة ، ضع الأنسجة في 70٪ من الإيثانول.

< p class = "jove_title" >2. معالجة الأنسجة

1. بعد تثبيت العينة ، قم بتشريح الأنسجة لتشمل مناطق الدماغ المهمة ، على سبيل المثال ، المقاطع العرضية لجذع الدماغ ، أو المخيخ (3 فصوص) ، أو الحصين (كلاهما الحصين) ، كل منها بسمك 3 إلى 5 مم ووضعها في أشرطة معالجة.
2. قم بمعالجة أشرطة الأنسجة لتسلل شمع البارافين ، مدمجة في كتل البارافين ومقسمة (3 إلى 6 ميكرومتر) على ميكروتوم.

< p class = "jove_title" >3. تحضير المواد / تلطيخ الأطباق

1. قم بإعداد طبق التلوين (جدول المواد) كما هو موضح في الشكل 1. املأ كل طبق ب 250 مل من المحلول.
2. تحضير محلول مخزون الركيزة 3-Amino-9-ethylcarbizole (AEC)
   1. قم بإذابة قرص واحد سعة 20 مجم من 3-أمينو 9-إيثيل كاربازول (AEC) إلى 5 مل من N ، N ، ثنائي ميثيل فورماميد باستخدام ماصة زجاجية.
      أنذر: AEC مادة مسرطنة.
3. تحضير محلول مخزون البروتياز (على سبيل المثال ، بروناز) لاسترجاع المستضد
   1. قم بإذابة 7 ملغ من البروتياز في 200 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
4. تحضير المخزن المؤقت للشطف PBS-T
   1. أضف 10 مل من Tween 80 إلى 990 مل من PBS. امزجها جيدا لتشكيل محلول متجانس.

< p class = "jove_title" >4. إزالة البارافينات وإعادة ترطيب الأنسجة

1. اصنع قسما من البارافين 5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم ، وقم بتعويمه على حمام مائي عند 38 درجة مئوية ، واجمعه على شرائح زجاجية. قم بتسمية الشرائح بقلم/قلم تحديد مقاوم للكاشف.
2. ضع الشرائح في صينية وذوبها في فرن 55-60 درجة مئوية لمدة ساعة. لا ترفع درجة الحرارة فوق 60 درجة مئوية لأنها يمكن أن تدمر المستضد الفيروسي.
3. أخرجي الشرائح من الفرن وأزيلي البارافينات على الفور في 3 شطفات متتالية من الزيلين لمدة 5 دقائق لكل منها في الأطباق 1 و 2 و 3.
4. أعد ترطيب الأقسام الموجودة على الشريحة عن طريق الغمر المتسلسل في تقليل تخفيف الإيثانول إلى الماء منزوع الأيونات: (4 إلى 11 هو شطف بالغمس) الطبق 4: الزيلين / 100٪ الإيثانول (1: 1) ؛ الطبق 5: 100٪ إيثانول ؛ الطبق 6: 100٪ إيثانول ؛ الطبق 7: 95٪ إيثانول ؛ الطبق 8: 95٪ إيثانول ؛ الطبق 9: 80٪ إيثانول ؛ الطبق 10: 70٪ إيثانول ؛ الطبق 11: الماء منزوع الأيونات (الشكل 1. إعداد الطبق).
   أنذر: الزيلين مادة كيميائية خطرة ويجب أن يتم العمل في غطاء الدخان.

< p class = "jove_title" >5. استرجاع المستضد المحلل للبروتين

1. عالج الشرائح بالبروتياز (2.5 ميكروغرام / مل من PBS) لمدة 30 دقيقة لاسترجاع المستضد المحلل للبروتين في الطبق 12.
2. ثم اشطفها في PBS-T لمدة 10 دقائق (الطبق 13).
3. عالج ب 3٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 10 دقائق (الطبق 14).
4. مرة أخرى ، اغسلها باستخدام PBS-T لمدة 10 دقائق (الطبق 15).

< ص الفئة = "jove_title" >6. إجراء تلطيخ

1. تعامل مع الشرائح واحدة تلو الأخرى مع إبقاء الشرائح المتبقية مغمورة في المخزن المؤقت (لا تقم بإزالة حامل الشريحة بالكامل - حافظ على الشرائح مبللة). قم بإزالة شريحة واحدة وامسح المخزن المؤقت الزائد (باستخدام منشفة ورقية) من حول قسم المناديل مع الحرص على عدم إزعاج قسم الأنسجة. احتضن الشرائح في حجرة الرطوبة ، المصنوعة عن طريق وضع مناشف ورقية مبللة ، على سطح مقعد المختبر في درجة حرارة الغرفة مع مصل الماعز العادي (الحظر) لمدة 15 دقيقة.
2. احتضان الجسم المضاد الأولي المضاد لداء المحدد مسبقا (تخفيف 1: 250 من مصل الفئران المضاد لداء ، غير منشور) (تحكم إيجابي) والأجسام المضادة للتحكم السلبي في درجة حرارة الغرفة كما هو مذكور أعلاه (الخطوة 6.1.) لمدة 60 دقيقة بدون غسلات بينهما.
3. بعد 60 دقيقة ، اغسلها باستخدام PBS-T لمدة 10 دقائق (الطبق 16).
4. احتضان الجسم المضاد الحيوي (الخاص بالأنواع) في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة (التعامل مع نفس الخطوة 6.1).
5. يغسل باستخدام PBS-T لمدة 10 دقائق (الطبق 16).
6. احتضان مركب الستربتافيدين - بيروكسيداز الفجل (HRP) في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة (التعامل مع نفس 6.1).
7. يغسل باستخدام PBS-T لمدة 10 دقائق (الطبق 16).
8. احتضن مع ركيزة البيروكسيديز، أمينو إيثيل كاربازول (AEC)، في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. للقيام بذلك ، أضف 1 مل من محلول مخزون AEC إلى 14 مل من محلول أسيتات 0.1M ، درجة الحموضة 5.2. أضف 0.15 مل من 3٪ بيروكسيد ، H₂O₂. قم بتصفية الخليط قبل الاستخدام مباشرة (مرشح 0.45 ميكرومتر).
   ملاحظه: حل العمل الخاص ب AEC مستقر فقط لمدة 2-3 ساعات. يمكن تخزين محلول مخزون AEC في الثلاجة لفترات أطول.
9. يغسل بالماء منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق (الطبق 17)
10. ملطخ بالهيماتوكسيلين المخفف 1: 2 بالماء منزوع الأيونات لمدة دقيقتين (الطبق 18).
11. اشطف الهيماتوكسيلين الزائد بغمس الماء منزوع الأيونات (الطبقان 19 و 20).
12. اشطفها في ماء الصنبور سكوت لمدة 30 ثانية (محلول أزرق) طبق 21.
13. يغسل في ماء منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق (الطبق 22)
14. قم بإزالة الشرائح واحدة تلو الأخرى - قم بتركيبها بوسيط تثبيت قابل للذوبان في الماء.
15. اقرأ الشرائح على المجهر الضوئي.

النتائج

الشكل 1: مخطط انسيابي يشير إلى خطوات مختلفة لاختبار IHC. 

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 3٪ بيروكسيد الهيدروجين ماركات فرعي جاهز على الرف 3٪ H2O2 3-أمينو-9-إيثيل كاربازول (AEC) ميليبور سيجما أ6926 الأسيتات عازلة الرقم الهيدروجيني 5.2 شركة بولي ساینتفيك للبحث والتطوير س 140 فورمالين مخزن 10٪ فوسفات مخزن فيشر ساينتيك SF100-4 معتمد زلات الغطاء كورنينج فيشر ساينتيك 12-553-471 24 × 50 مم دليل على الإيثانول 190 فارمكو AAPER 111000190 دليل على الإيثانول 200 فارمكو AAPER 111000200 تركيبة هيماتوكسيلين جيل # 2 فيشر ساينتيك عال 401-1 د مجموعة هيستومارك بيوتين ستربتافيدين بيروكسيداز سيراكير 71-00-18 الجسم المضاد الأساسي للفأر ImmunoHistoMount ميليبور سيجما [إي1161] تركيب الوسائط N ، N ، ثنائي ميثيل فورماميد GR فيشر ساينتيك د119 محلول ملحي مخزن بالفوسفات HyClone RR14440.01 01 م ، درجة الحموضة 7.2 (الرقم الهيدروجيني 7.2-7.6) خطة - APOCHROMAT 40X / 0.95 الهدف بائعين متعددون الهدف الخطة APOCHROMATIC 20X/0.75 بائعين متعددون بروناز ميليبور سيجما 53702 البروتياز ، Streptomyces griseus ماء الصنبور سكوت شركة بولي ساینتفيك للبحث والتطوير س 1887 مجموعة بقع Tissue-Tek Slide فيشر ساينتيك 50-294-72 توين -80 ميليبور سيجما ص 1754 الزيلين فيشر ساينتيك X3S-4 الصف النسيجي تصوير Zeiss Axioplan 2 - مجهر بائعين متعددون