$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
< p class = "jove_title" >
1. التحضير النسيجي المرضي والمعالجة بعد الحصول على خزعة الشريان الصدغي
ملاحظة: يتم إجراء خزعة الشريان الصدغي (TAB) تحت التخدير الموضعي والظروف المعقمة من قبل جراح معتمد. بعد الحصول جراحيا على قسم شرياني بطول 3 سم على الجانب الأكثر تضررا ، يتم تثبيت العينة في الفورمالين على الفور لمدة 24 ساعة ، مقسمة إلى أقسام من 3 إلى 4 مم ، ومدمجة في البارافين ، مع إيلاء اهتمام دقيق للمحاذاة المناسبة للأنسجة في الكتلة التي يتم تخزينها بعد ذلك في درجة حرارة الغرفة. يتم اختيار العينات بعد التحقق من السجلات الطبية. يعتمد التشخيص على معايير الكلية الأمريكية لأمراض الروماتيزم لعام 1990 والتي تتطلب أن يستوفي الأشخاص 3 من 5 مجالات: العمر >50 عاما ، والصداع الجديد ، وألم الشريان الصدغي ، ومعدل ترسيب كريات الدم الحمراء >50 مم / ساعة بطريقة Westergren ، و TAB غير طبيعي. من أجل السلامة ، يجب ارتداء القفازات الواقية في جميع الأوقات عند التعامل مع العينات ، المواد الكيميائية والأجسام المضادة.
- من الكتل المضمنة ، قم بقص أقسام بسمك 4-5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم. وصمة عار باستخدام الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E). استخدم قسم التحكم في الأنسجة الطبيعية المختارة لضمان الجودة.
- قم بتعويم الأقسام المقطوعة على حمام ماء دافئ يتم تسخينه إلى 40 درجة مئوية لإزالة التجاعيد والتقاطها بشريحة زجاجية مجهرية مطلية. ضع الشرائح الزجاجية على طبق دافئ في فرن 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة لتسهيل تجفيف القسم وإلتصاقه بالشريحة.
- ضع الشرائح الزجاجية على طبق دافئ في فرن 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة لتسهيل التجفيف والالتصاق القسم بالشريحة.
- قم بتركيب 3 أقسام على شرائح المجهر.
- ضع الشرائح في رف عمودي وجففها طوال الليل عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- ضع الشرائح في وعاء وخزنها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
فئة
2. التحضير الكيميائي المناعي ، وإزالة الشمع ، واسترجاع المستضد والتلوين
- قم بتحميل الشرائح في رف الشرائح. قم بتشغيل الرف عبر الأطباق على النحو التالي: مرتين في 100٪ زيلين لمدة 5 دقائق مع 10 ثوان من التحريك اللطيف كل 30 ثانية ، مرة في 100٪ إيثانول مع 10 ثوان من التحريك ، مرة واحدة في 90٪ إيثانول مع 10 ثوان من التحريك ، مرة واحدة في 70٪ إيثانول مع 10 ثوان من التحريك ، ومرتين في H2O المقطر المزدوج مع 10 ثوان من التقليب. < / >
ملاحظه: يجب أن يتم التعامل مع الزيلين والأسيتون في أغطية جيدة التهوية لتجنب الاستنشاق وسمية الجهاز التنفسي.
- استرجع المستضد عن طريق نقل الرف إلى وعاء زجاجي به 200 مل من 10 مليمول / لتر ، درجة حموضة 6.0 سترات مخفف مسبقا إلى 95 درجة مئوية. اضبط المؤقت لمدة 30 دقيقة في الحمام المائي ، ثم تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ثم اشطفها بالماء الجاري لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة نشاط البيروكسيديز الداخلي عن طريق احتضان 200 مل من بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 10 دقائق. اغسل الشرائح 3 مرات في 200 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن في تريس (TBSS).
- قم بإزالة الشرائح من الرف وامسح كل واحدة برفق لمسح المخزن المؤقت الزائد. للتلوين ، أضف 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية التالية ، وأضف أغطية على الشرائح ، واحتضن في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة:
الأجسام المضادة لمستقبلات حمض الفوليك بيتا (FRB) مخففة 1: 800
فأر أحادي النسيلة مضاد للإنسان CD68 ، 1: 200 تخفيف
أرنب متعدد النسيلة مضاد ل CD3 1: 100 التخفيف
ملاحظه: تمت معالجة الأجزاء المضمنة في البارافين المثبتة بالفورمالين من المشيمة كما هو موضح في الخطوات من 2.1 إلى 2.9 ، وتم تحضينها بمضاد FRB18 ، واستخدمت كعنصر تحكم إيجابي. تم الحصول على نتائج التلوين من خلال إيجاد التركيز الأمثل للجسم المضاد وتم إجراؤه عن طريق معايرة الجسم المضاد في تخفيفات مزدوجة (على سبيل المثال ، 1:50 ، 1: 100 ، 1: 200 ، 1: 400 ، 1: 800 ، 1: 1600).
- قم بإزالة الغطاء بعد الحضانة وتخلص منه. اشطف الشرائح 3 مرات لمدة دقيقتين لكل منهما باستخدام TBSS ، ثم صفيها وامسح المحلول الزائد.
- أضف 200 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الثانوي الذي يحتوي على الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب / الفأر البيوتينيل للتفاعل مع الجسم المضاد الأولي غير المترافق المرتبط بمستضد الأنسجة. ضع أغطية على الشرائح واحتضنها في غرفة رطبة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة الغطاء بعد الحضانة وتخلص منه. اشطف الشرائح 3 مرات لمدة دقيقتين لكل منهما باستخدام TBS ، ثم صفيها وامسح المحلول الزائد
- أضف 200 ميكرولتر من diaminobenzidine (DAB) + عازلة الركيزة (Imidazole HCl) - نظام الكروموجين واحتضنه لمدة 10 دقائق لتصور نمط التلوين. يغسل ب TBSS ثم في ماء الصنبور الجاري لمدة 10 دقائق.
- مضاد للبقع مع الهيماتوكسيلين لمدة 3 دقائق.
- قم بتركيب الشرائح عن طريق تطبيق 70 ميكرولتر من وسط التثبيت على سطح الشريحة. قم بقلب الغطاء ببطء على وسط التثبيت وتجنب تكوين فقاعات أثناء خفضه في مكانه. انتظر 24 ساعة حتى يجف.
< p class = "jove_title" >
3. التحليل النسيجي المرضي والكيميائي المناعي (IHC)
افحص الأقسام الملطخة ب H & E و IHC من الأشخاص الإيجابيين والعاديين باستخدام المجهر الضوئي.
- للأقسام الملطخة ب H & E
- تقييم بنية الأوعية الدموية وتحديد الخلايا البطانية في الغلالة الإنتيما، وخلايا العضلات الملساء في وسط الغلالة، والخلايا الليفية والأوعية الوعائية في الغلالة الوعائية.
- تحديد ميزات GCA ، والتي تشمل تسلل الخلايا الليمفاوية والبلاعم / الخلايا النسيجية ، وتضخم الخلايا ، وتدهور الصفيحة المرنة الداخلية.
- تحليل تسلل الخلايا الليمفاوية عن طريق تحديد وتحديد عدد البلاعم بالنسبة للخلايا الليمفاوية. تقييم مدى اضطراب الصفيحة المرنة الداخلية والتغيرات المفرطة التنسج في الخلايا المقيمة ومقارنتها بالضوابط.
- للأقسام الملطخة بالمدينة العالمية
- افحص نمط تلطيخ FRB ، مع ملاحظة تعبيره بنوع أو أنواع معينة من الخلايا وتوزيعه داخل طبقات الأوعية الدموية وعلاقته بالتسلل المناعي الكلي ، وعلامة البلاعم الكلية ، ومضاد CD68 ، وعلامة الخلايا الليمفاوية المضادة ل CD3.
- حدد كمية التعبير عن خلايا FRB و CD68 و CD3 عن طريق حساب الخلايا الملطخة بشكل إيجابي على 10 حقول عالية طاقة متعددة مختارة عشوائيا (hpf) وتسجيل الوسائل. < br / >
ملاحظه: تم تحديد هذه الخلايا والهياكل الطبيعية والمرضية من قبل أخصائي أمراض القلب والأوعية الدموية المعتمد وأخصائي الروماتيزم ، وتم تسجيل النتائج لجميع الحالات.
- التقط صورا تمثيلية باستخدام كاميرا رقمية.
ملاحظة: بعد هذه الخطوات ، يمكن تخزين الحصص المتبقية عند -80 درجة مئوية.