$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
فئة
1. حصاد الأنسجة والتشابك بالأشعة فوق البنفسجية
- قتل 2 من الفئران البالغة باستخدام ثاني أكسيد الكربون (CO2) لمدة 1-2 دقيقة أو حتى يتوقف التنفس. بعد ذلك ، قم بإجراء خلع عنق الرحم على كل فأر.
- احصد حوالي 100 مجم من الخصيتين من الفئران ذات العمر المناسب (خصية بالغة واحدة في هذه الدراسة) لكل تجربة ترسيب مناعي ، وضع الأنسجة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج (PBS).
- قم بإزالة الغلالة البرفقية برفق باستخدام زوج واحد من الملقط ذي الرؤوس الدقيقة.
- أضف 3 مل من PBS المثلج في مطحنة الأنسجة وقم بترتيشر الأنسجة بقوة ميكانيكية خفيفة باستخدام مدقة زجاجية فضفاضة (مدقة زجاجية من النوع A).
ملاحظة: الغرض من هذه الخطوة ليس تحلل الخلايا ، ولكن تفكيك الأنسجة. من المهم الحفاظ على صلاحية الخلية وسلامتها.
- انقل تعليق الأنسجة إلى طبق زراعة الخلايا (قطره 10 سم) وأضف PBS المثلج حتى 6 مل.
- رج الطبق بسرعة حتى يغطي السائل قاع الطبق بالتساوي. إذا تم طحن الأنسجة بشكل صحيح ، فستكون الأنابيب المنوية الموزعة بالتساوي مرئية ، في حين أن وجود كتل الأنسجة يشير إلى أن تشتت الأنسجة دون المستوى الأمثل.
- ربط التعليق ثلاث مرات مع 400 [مل] جول/سم2 عند 254 [نم] على جليد. امزج التعليق بين كل تشعيع.
ملاحظه: لكل تجربة جديدة ، يجب تحسين التشابك.
- اجمع التعليق في أنبوب مخروطي 15 مل وحبيبات عند 1,200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من PBS ، ثم انقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. تدور عند 4 درجات مئوية و 1,000 × جم لمدة دقيقتين ، وقم بإزالة المادة الطافية.
- في هذه المرحلة ، تابع على الفور بقية البروتوكول ، أو قم بتجميد الكريات في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
< ص الفئة = "jove_title" >
2. تحضير الخرز
- أضف 125 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي للبروتين أ لكل عينة (بيليه) إلى أنبوب طرد مركزي جديد.
ملاحظه: استخدم حبات البروتين G المغناطيسية للأجسام المضادة للفأر.
- ضع الأنبوب على المغناطيس لفصل الخرز عن المحلول. بعد 10 ثوان ، قم بإزالة المادة الطافية. اغسل الخرز مرتين باستخدام 1 مل من محلول التحلل المثلج البارد.
ملاحظه: يتبع هذا الخطوة، الفصل اللاحق للخرز المغناطيسي للبروتين. تكوين المخزن المؤقت للتحلل هو 50 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5 ؛ 100 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 1٪ NP-40 ؛ 0.1٪ SDS; 0.5٪ ديوكسي كولات الصوديوم. 1/50 كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) (يضاف طازج).
- أعد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل البارد مع 10 ميكروغرام من الجسم المضاد eCLIP. قم بتدوير الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة < / >
ملاحظه: تركيز الجسم المضاد النهائي للترسيب المناعي هو 10 ميكروغرام / مل. إذا كان تركيز الجسم المضاد غير معروف ، فيجب تحسين كمية الجسم المضاد.
- اغسل الخرزات مرتين باستخدام 1 مل من محلول التحلل المثلج.
فئة
3. تحلل الأنسجة والهضم الجزئي للحمض النووي الريبي
- أعد تعليق كريات الأنسجة في 1 مل من المخزن المؤقت للتحلل البارد (أضف 22 ميكرولتر من كوكتيل مثبط البروتين الخالي من 50x (EDTA) و 11 ميكرولتر من مثبط RNase إلى 1 مل من محلول التحلل).
- إعادة تعليق كريتين متشابكتين بالأشعة فوق البنفسجية واثنين من الكريات غير المتشابكة لكل مجموعة من التجارب: كريات UV-Connected -1 لمكتبة eCLIP (UV-1) ؛ كريات UV-crosslinked-2 لمكتبة eCLIP (UV-2) ؛ كريات غير مترابطة -1 لمكتبة eCLIP كعنصر تحكم (غير UV) ؛ كريات 2 غير مترابطة ل IgG IP لإثبات خصوصية الأجسام المضادة.
ملاحظه: التحكم المثالي لمكتبة eCLIP للخصيتين العريضتين المتشابكتين بالأشعة فوق البنفسجية هو التحكم في خصيتين الضربة القاضية المتشابكة بالأشعة فوق البنفسجية من الفئران من نفس القمامة.
- استمر في تحلل العينات على الثلج لمدة 15 دقيقة (لمنع تحلل البروتين والحمض النووي الريبي).
- صوتي في سونيكاتور رقمي بسعة 10٪ لمدة 5 دقائق ، عند 30 ثانية / 30 ثانية. ضع العينة دائما على الثلج ونظف المسبار بالماء الخالي من النوكلياز بين كل عينة.
- أضف 4 ميكرولتر من DNase إلى كل أنبوب ، واخلط جيدا. احتضن لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، مع الاهتزاز عند 1,200 دورة في الدقيقة.
- أضف 10 ميكرولتر من RNase I المخفف (4 U / μL RNase I في PBS) ، واخلطه جيدا. احتضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، مع الاهتزاز عند 1,200 دورة في الدقيقة.
- قم بتنظيف المحللة عن طريق الطرد المركزي عند 15,000 × جم لمدة 20 دقيقة (عند 4 درجات مئوية).
- اجمع المادة الطافية بعناية. اترك 50 ميكرولتر من المحللة وتخلص من الحبيبات معها.
- حفظ عينات الإدخال ك RWB (تشغيل للبقعة الغربية) و RRI (تشغيل لعزل الحمض النووي الريبي). وفر 20 ميكرولتر (2٪) من عينات UV-1 و UV-2 و non-UV و IgG كمدخلات لتحميل هلام RWB. وفر 20 ميكرولتر (2٪) من عينات الأشعة فوق البنفسجية -1 أو الأشعة فوق البنفسجية -2 كمدخلات لتحميل هلام RRI.
< p class = "jove_title" >
4. الترسيب المناعي
- أضف 1 مل من المحللة (من الخطوة 3.7) إلى الخرزات (المحضرة في القسم 2) وقم بتدوير العينات عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين أو بين عشية وضحاها.
- اجمع الخرزات بحامل مغناطيسي وتخلص من المادة الطافية. اغسل الخرزات مرتين باستخدام 900 ميكرولتر من محلول الملح العالي (50 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5 ؛ 1 M كلوريد الصوديوم ؛ 1 ملي EDTA ؛ 1٪ NP-40 ؛ 0.1٪ SDS ؛ 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم) ، ثم اغسل الخرزات مرتين باستخدام 900 ميكرولتر من محلول الغسيل (20 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5 ؛ 10 ملي مولار MgCl2 ؛ 0.2٪ Tween-20).
ملاحظه: بالنسبة لعينة IgG ، أوقف الإجراء مؤقتا هنا وقم بتخزينه على الثلج في مخزن غسيل.