اختبار لتحليل دورة الخلية لخلايا CD8 + التائية الخاصة بالمستضد

الملخص

المصدر: Simonetti ، S. ، et al. مقايسة قياس التدفق الخلوي المستندة إلى الحمض النووي / Ki67 لتحليل دورة الخلية لخلايا CD8 T الخاصة بالمستضد في الفئران الملقحة.

يوضح هذا الفيديو فحصا لتحليل خلايا CD8 ⁺ T الخاصة بالمستضد في مراحل دورة الخلية المختلفة. يتم اختيار الخلايا القابلة للحياة ذات العلامات الفلورية باستخدام قياس التدفق الخلوي ، ويتم تحديد الخلايا في مراحل دورة الخلية المختلفة من خلال محتواها من الحمض النووي باستخدام الأجسام المضادة ضد البروتين النووي المرتبط بتكاثر الخلايا وصبغة الحمض النووي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير محلول متوسط وتلوين

1. تحضير الوسط الكامل: وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) مع 2 ملي مولار من الجلوتامين ، و 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين ، و 50 ميكرومتر من بيتا ميركابتو إيثانول ، و 10٪ حجم / حجم (حجم / حجم) من مصل الأبقار الجنينية (FBS)
2. تحضير المخزن المؤقت للتلطيخ: محلول ملحي مخزن بالفوسفات بدون Ca^{2 + /} Mg²⁺ (PBS) مع 1٪ وزن / حجم (وزن / حجم) ألبومين مصل الأبقار (BSA) و 2 ملي مولار ملح ثنائي الصوديوم حمض إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)

< p class = "jove_title" >2. علاج الفأر

1. فئران Balb / c الإناث البالغة من العمر 7-8 أسابيع عن طريق الحقن العضلي (i.m) في عضلات الفخذ من فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) -1-gag-expressing-denoviral الناقل الفيروسي الغدي للشمبانزي (ChAd3-gag) بجرعة 10⁷ جزيئات فيروسية.
2. في 1-4 أشهر بعد التحضير ، قم بتعزيز الفئران مرة واحدة عن طريق حقن فيروس نقص المناعة البشرية 1-gag المعدل لفيروس أنقرة (MVA-gag) بجرعة 10⁶ وحدات لتشكيل البلاك.
3. في اليوم 3 بعد التعزيز ، ضحي بالفئران المعززة عن طريق خلع عنق الرحم ، وقم بتحليلها بالتوازي مع الفئران غير المعالجة.
4. احصد الغدد الليمفاوية (LNs) التي تستنزف عضلات الفخذ (الحرقفية والمأبضية والإربية) والطحال من الفئران المعززة وغير المعالجة. علاوة على ذلك ، اجمع نخاع العظم (BM) من الساقين الخلفيتين من الفئران غير المعالجة ، واستخدم BM هذا لإعدادات مقياس التدفق الخلوي وكتحكم إيجابي لتحليل دورة الخلية (الشكل 1).
   ملاحظه: قم بإنشاء متجهات ChAd3-gag و MVA-gag كما هو موضح سابقا.

< p class = "jove_title" >3. عزل LN المستنزف والطحال

1. عزل الطحال وخلايا LN
   1. ضع 5 مل من الوسط الكامل في كل من أنبوبين سعة 15 مل ، واحتفظ بهما على الجليد ، جاهزين لجمع الأعضاء.
   2. التضحية بفأر بالغ عن طريق خلع عنق الرحم.
   3. ضع الماوس على ظهره ، وقم بتعقيم سطح الجلد بنسبة 70٪ من الإيثانول الحجمي.
   4. لجمع LNs الإربية ، قم بعمل شق طولي ~ 1 سم على البطن بالمقص ، وقم بتمديد الشق بالملقط.
   5. تصور LNs الإربية على السطح الداخلي للجلد ، واحصدها بالملقط. ضع LNs الأربية في أحد الأنبوبين سعة 15 مل المحضرين في الخطوة 3.1.1.
   6. لجمع الطحال ، قم بعمل شق بريتوني بالمقص وإزالة الطحال. بعد قطع النسيج الضام المحيط ، ضع الطحال في الأنبوب الثاني سعة 15 مل المحضر في الخطوة 3.1.1.
   7. لجمع LNs الحرقفية ، حرك الأمعاء جانبا وتصور LNs الحرقفي بالقرب من الوريد الأجوف السفلي ، ثم اجمعها باستخدام الملقط. ضع LNs الحرقفية في نفس الأنبوب الذي يحتوي على LNs الإربي.
      ملاحظه: للحصول على ما يكفي من خلايا LN للتلوين (انظر القسم 4) ، غالبا ما يكون من الضروري تجميع LNs المأبضية والإربية والحرقفية من فأر واحد. تعمل جميع LNs هذه على تصريف عضلات الفخذ (موقع التطعيم IM). يستخدم هذا البروتوكول أنبوبا واحدا فقط سعة 15 مل من LNs المجمعة.
   8. لجمع LNs المأبضية ، أمسك جلد الساقين الخلفيتين واسحبه برفق لأسفل لكشف العضلات. ثم أدخل الملقط بين العضلات الموجودة أسفل مفصل الركبة ، واجمع LNs المأبضية. ضع LNs المأبضية في نفس الأنبوب الذي يحتوي على LNs الأربية والحرقفية.
      ملاحظه: انظر الحاشية بعد 3-1-7.
   9. ضع الطحال في مصفاة خلوية 70 ميكرومتر داخل طبق استزراع 60 مم مملوء ب 5 مل من الوسط الكامل. باستخدام مكبس حقنة سعة 5 مل ، اهرسي العضو برفق حتى يتم تفكيكه بالكامل.
   10. قم بإزالة المصفاة ، وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب نظيف سعة 15 مل.
   11. أضف 5 مل من الوسط الكامل إلى طبق المزرعة ، واغسل الطبق والمصفاة بعناية للتأكد من استعادة جميع الخلايا. تجمع مع بقية تعليق خلايا الطحال في أنبوب 15 مل.
   12. بالنسبة للشبكات LN الأربية والحرقفية والمأبضية المجمعة ، قم بإعداد تعليق أحادي الخلية باتباع إجراء مشابه لتلك المستخدمة في الخطوات 3.1.9 إلى 3.1.11 للطحال.
   13. خلايا الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق كريات الخلية في PBS.
   14. عد الخلايا بغرفة Neubauer باستخدام المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء و 0.04٪ v / v trypan blue في PBS.

< p class = "jove_title" >4. تلطيخ الطحال ، LN

1. تقسيم عينات الخلايا المراد تلطيخها إلى 3 مجموعات فرعية: عينات الخلايا للتعويض ، بما في ذلك خلايا BM من الفئران غير المعالجة التي يجب تلطيخها فقط باستخدام Hoechst 33342 (يشار إليها من الآن فصاعدا باسم Hoechst) ، وخلايا الطحال من الفئران غير المعالجة لاستخدامها لإعداد مزيج الخلايا الميتة / الحية لتعويض صبغة الخلايا الميتة ؛ التحكم الإيجابي لتحليل دورة الخلية ، الذي يتكون من عينة BM من الفئران غير المعالجة ؛ والعينات التجريبية التي تحتوي على عينات الطحال وLN من الفئران غير المعالجة والملقحة.
   ملاحظه: تأكد من وجود ما يكفي من خلايا الطحال و LN لتحليل أعداد كافية من خلايا CD8 T الخاصة بكمامة. غالبا ما يكون من الضروري استخدام خلايا الطحال المجمعة وخلايا LN المجمعة من 3 فئران محصنة وتلطيخ عينتين متطابقتين أو أكثر من الخلايا المجمعة ، تحتوي كل منها على 3 × 10⁶ خلايا. دمج عينات متطابقة في خطوة تلطيخ Hoechst. وبالمثل ، قم بتلطيخ خلايا الطحال المجمعة وخلايا LN من 3 فئران غير معالجة ، ودمج عينات متطابقة في النهاية. ضع جانبا عينة غير ملوثة من خلايا الطحال من فأر غير معالج لاستخدامها في إعداد الأداة والتعويض.
2. قم بإعداد مزيج الخلايا الميتة / الحية لتعويض صبغة الخلايا الميتة (سيتم تلطيخ هذا المزيج من الخلايا فقط بصبغة الخلايا الميتة).
   1. سخني حمام مائي على حرارة 65 درجة مئوية.
   2. خذ حصة من خلايا الطحال (~ 3 × 10⁶).
   3. انقل معلق الخلية إلى أنبوب ميكروفوجوج ، وضعه في حمام مائي عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم ضعه على الفور على الجليد لمدة 10 دقائق.
   4. امزج الخلايا المقتولة بالحرارة مع خلايا الطحال الحية (~ 3 × 10⁶) بنسبة 1: 1 ، وانقل نصف الخليط إلى 96 صفيحة سفلية مستديرة جيدا (~ 3 × 10⁶ خلايا / بئر للتحكم في تلطيخ الخلايا الميتة).
3. تلطيخ الخلايا الميتة للعينات التجريبية ، والتحكم الإيجابي لتحليل دورة الخلية ، ومزيج الخلايا الميتة / الحية
   1. نقل الطحال ، LN ، خلايا BM (3 × 10⁶ خلايا / بئر) ، ومزيج الخلايا الميتة / الحية (القسم 4.2) إلى صفيحة مستديرة القاع مكونة من 96 بئرا ، وفقا لمخطط التلوين (الخطوة 4.1) ، وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   2. أعد تعليق كل حبيبات خلية في 50 ميكرولتر من صبغة الخلايا الميتة المخففة في PBS ، وأعد تعليقها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 3 مرات على الفور.
   3. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء.
   4. اغسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن مؤقت للتلطيخ ؛ المرة الأولى ب 200 ميكرولتر والمرة الثانية ب 250 ميكرولتر. لكل غسل ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 400 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   5. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 20 ميكرولتر من PBS.
4. تلطيخ الخلايا الغشائية بمضاعفات الببتيد المعقدة الرئيسية للتوافق النسيجي (MHC) والأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs).
   1. مع مراعاة الأحجام اللازمة وفقا لمخطط التلوين (إعدادات مقياس التدفق الخلوي ، الجدول 1) ، قم بإعداد الكواشف التالية:
      قم
      1. بتخفيف mAb 2.4G2 في مخزن التلوين وفقا للتخفيف المناسب (انظر جدول المواد) ؛ لكل عينة يتم تلطيخها ، استخدم 10 ميكرولتر من هذا التخفيف.
         ملاحظة: يمنع 2.4G2 mAb الارتباط غير الخاص بالمستضد للجلوبولين المناعي بمستقبلات FcγIII و FcγII.
      2. قم بتخفيف الرباعي المسمى H-2k (d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC) (Tetr-gag) في مخزن التلوين للحصول على التخفيف المناسب (انظر جدول المواد) ؛ لكل عينة يتم تلطيخها ، استخدم 20 ميكرولتر من هذا التخفيف.
      3. قم بإعداد مزيج الأجسام المضادة عن طريق تخفيف mAbs في مخزن التلوين وفقا للتخفيف المناسب (انظر جدول المواد) الذي تم تحديده مسبقا في تجارب المعايرة بالتحليل الحجمي ؛ لكل عينة سيتم تلطيخها ، استخدم 20 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة هذا.
         ملاحظه: هنا ، تم استخدام بروتين الكلوروفيل المضاد ل CD3e peridinin (PerCP-Cy5.5) (استنساخ 145-2C11) ، والأشعة فوق البنفسجية الرائعة المضادة ل CD8a (BUV805) (استنساخ 53-6.7) ، ومضاد CD62L phycoerythrin cyanine7 (PECy7) (استنساخ MEL-14).
   2. أضف 10 ميكرولتر من 2.4G2 مللي أمبير المخفف مسبقا (الخطوة 4.4.1.1) ، واحتضنه لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، محميا من الضوء.
   3. أضف 20 ميكرولتر من ناقلة الجنود المدرعة Tetr-gag المخففة مسبقا (الخطوة 4.4.1.2) و 10 ميكرولتر من H-2k (d) AMQMLKETI phycoerythrin (PE) pentamer (pent-gag). احتضن لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء.
   4. أضف 20 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة المحضر مسبقا (الخطوة 4.4.1.3) ، واحتضنه لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، محميا من الضوء.
      ملاحظه: ومن ثم ، فإن الحجم النهائي هو 80 ميكرولتر لكل بئر (الخطوة 4.3.5 ، الخطوات 4.4.2 إلى 4.4.4).
   5. اغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   6. أعد تعليق حبيبات الخلية في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلوين ، وانقل تعليق الخلية إلى 5 أنابيب مل. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للتلوين إلى الأنبوب ، وجهاز الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   7. خذ حصة خلايا BM (3 × 10⁶ خلايا) (انظر قائمة عينات الخلايا ، القسم 4.1) لاستخدامها لتعويض قناة Hoechst (Hoechst 33342 متحمس بواسطة ليزر فوق بنفسجي (إعدادات مقياس التدفق الخلوي (الجدول 2)) ، وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب 5 مل. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للتلوين إلى الأنبوب ، وجهاز الطرد المركزي 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.

< p class = "jove_title" >5. التثبيت / النفاذية

1. قم بإعداد مخزن مؤقت جديد للتثبيت / النفاذية عن طريق تخفيف جزء واحد من تركيز التثبيت / النفاذية مع 3 أجزاء من مخفف التثبيت / النفاذية ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. تخلص من المادة الطافية ودوامة النبض للعينات لتفكيك الحبيبات تماما.
3. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للتثبيت / النفاذية المعد حديثا إلى كل أنبوب ، بما في ذلك أنبوب به خلايا طحال غير ملطخة (3 × 10⁶ ، انظر قائمة عينات الخلايا ، القسم 4.1) ، والدوامة.
4. احتضان لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

< p class = "jove_title" >6. تلطيخ داخل الخلايا

1. تلطيخ Ki67
   1. قم بإعداد عازلة نفاذية طازجة 1x عن طريق تخفيف عازلة النفاذية 10x بالماء المقطر ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قبل الاستخدام ، يجب تصفية المخزن المؤقت للنفاذية 1x من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر للتخلص من الركام.
   2. تمييع mAb Ki67 isothiocyanate الفلوريسئين (FITC) (استنساخ SolA15) في المخزن المؤقت للنفاذية 1x (انظر جدول المواد) ، كما هو محدد سابقا في تجارب المعايرة بالتحليل الحجمي (الحجم النهائي 100 ميكرولتر لكل عينة).
   3. أضف 3 مل من عازلة النفاذية 1x إلى كل أنبوب ، وجهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
   4. تخلص من المادة الطافية وكرر الخطوة 6.1.3.
   5. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من mAb Ki67 FITC المخفف مسبقا (الخطوة 6.1.2).
   6. احتضن لمدة 30 دقيقة في RT ، محمي من الضوء.
   7. اغسل الخلايا مرتين ب 4 مل من المخزن المؤقت للنفاذية 1x. لكل جهاز طرد مركزي للغسيل عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
   8. أعد تعليق حبيبات الخلية في PBS مع مراعاة الأحجام التالية: 350 ميكرولتر من PBS للعينات التي سيتم الحصول عليها مباشرة في مقياس التدفق الخلوي ؛ 250 ميكرولتر من PBS للعينات التي سيتم تحضينها باستخدام Hoechst قبل وقت قصير من قياس التدفق الخلوي (القسم 6.2).
2. تلطيخ الحمض النووي
   1. أضف 250 ميكرولتر من 4 ميكروغرام/مل Hoechst في PBS إلى كل عينة (التركيز النهائي ل Hoechst هو 2 ميكروغرام/مل).
      ملاحظة: في حالة تحضير عينتين متطابقتين أو أكثر من 250 ميكرولتر في PBS ، قم بدمجها في هذه الخطوة ، وأضف حجما متساويا من محلول Hoechst 4 ميكروغرام / مل في PBS (التركيز النهائي ل Hoechst هو 2 ميكروغرام / مل). يؤثر عدد الخلايا بشكل كبير على خطوة تلطيخ الحمض النووي. استخدم نفس رقم الخلية في كل عينة. اعلم أنه حتى عدد الخلايا المنخفض قليلا (على سبيل المثال ، بسبب فقدان الخلايا في خطوات الغسيل السابقة) يؤدي إلى ارتباط Hoechst أعلى بالحمض النووي وزيادة كثافة Hoechst.
   2. احتضن لمدة 15 دقيقة في RT ، محمي من الضوء.
   3. الطرد المركزي للعينات عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
   4. أعد تعليق حبيبات الخلية في 350 ميكرولتر من PBS.

< p class = "jove_title" >7. تحضير عينات حبة التعويض

1. تحضير 5 ميكرولتر من الجسم المضاد عن طريق تخفيف mAb في مخزن التلوين بشكل مناسب.
   ملاحظه: لكل mAb مترافق بالفلوروكروم المستخدم في التجربة ، قم بإعداد عينة حبة التعويض المقابلة.
2. التحكم السلبي الدوامة ومكافحة الفئران / الهامستر Ig ، κ Comp الخرز قبل الاستخدام.
3. لكل عينة ، أدخل قطرة واحدة (~ 20 ميكرولتر) من CompBeads للتحكم السلبي وقطرة واحدة من Anti-Rat/Hamster Ig ، k CompBeads.
4. أضف 5 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف مسبقا (الخطوة 7.1) إلى الأنبوب، وقم بسحب الماصة لأعلى ولأسفل.
5. احتضن لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء.
6. اغسل العينات ب 2 مل من المخزن المؤقت للتلطيخ. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
7. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات بإضافة 500 ميكرولتر من PBS إلى كل أنبوب ودوامة.

8. إعداد الأداة والتعويض والحصول على العينة التجريبية في مقياس التدفق الخلوي

ملاحظة: ارجع إلى إعدادات مقياس التدفق الخلوي (الجدول 2) لتكوين مقياس الخلوي.

1. إعداد الصك العام والتعويض
   1. افتح البرنامج للحصول على عينة (راجع جدول المواد)، وقم بإنشاء تجربة جديدة بالنقر فوق تجربة جديدة في قسم شريط مساحة العمل وتحديد تجربة فارغة جديدة.
   2. انقر نقرا مزدوجا فوق التجربة التي تم إنشاؤها لفتحها.
   3. في نافذة إعدادات مقياس الخلايا ، انقر فوق المعلمات وحدد جميع القنوات (على سبيل المثال ، PE ، APC ، إلخ) المستخدمة في لوحة التلوين بما في ذلك معلمات التشتت الأمامي (FSC) والمبعثر الجانبي (SSC).
   4. حدد المقياس الخطي كمعلمة Hoechst عن طريق إلغاء تحديد مقياس السجل ، وتحقق من العرض (W) لنبضة الجهد ل FCS و SSC و Hoechst.
      ملاحظه: يتم عرض جميع المعلمات افتراضيا في مقياس لوغاريتمي (لوغاريتمي) ، باستثناء FSC و SSC اللذين يكونان في مقياس خطي. يتم تحليل جميع المعلمات حسب المنطقة (A) والارتفاع (H) لنبضة الجهد.
   5. في ورقة العمل العمومية، قم بإنشاء مخطط نقطي باستخدام FSC-A على المحور x و SSC-A على المحور y.
   6. قم بتشغيل عينة الطحال غير الملوثة بالنقر فوق الحصول على البيانات في لوحة معلومات الاكتساب.
   7. قم بتعيين إعدادات FSC و SSC المناسبة لتصور الخلايا عن طريق تعديل قيم الجهد في قسم المعلمات ، وإنشاء بوابة لتحديد جميع الخلايا المعروضة في مخطط نقطة FSC-A / SSC-A بالنقر فوق Polygon Gate على شريط أدوات مساحة العمل في ورقة العمل العمومية.
   8. اعرض الخلايا المسورة في الرسوم البيانية مع كل معلمة مضان على المحور السيني.
   9. قم بتشغيل عينات الطحال غير الملوثة والملطخة بالكامل لضبط كاشف التألق (PMT) للحصول على فصل واضح بين الإشارات السلبية والإيجابية للخلايا الملطخة لكل معلمة تألق.
   10. لإجراء إعداد التعويض، انقر فوق تجربة في شريط مساحة العمل، وضمن قسم إعداد التعويض، حدد إنشاء عناصر تحكم التعويض. قم بإلغاء تحديد Include Unstained Control Tube / Well وانقر فوق OK.
       ملاحظه: ستؤدي هذه العملية إلى إنشاء عينة تسمى عناصر التحكم في التعويض وورقة عمل عادية تحتوي على عدة أوراق تتوافق مع كل معلمة محددة.
   11. قم بتشغيل عينة من حبات التعويض (انظر القسم 6) ؛ قم بتعيين إعدادات FSC و SSC المناسبة لتصور الخرزات عن طريق تعديل قيم الجهد وعتبة الاستحواذ البالغة 5,000 على معلمات FSC في نافذة مقياس الخلايا.
   12. اضبط بوابة P1 على مجموعة الخرزة ، وتحقق من أن القمتين الموجبة والسالبة مرئيتان على المحور x. كرر هذه العملية لكل عينة حبة تعويض، وأخيرا قم بتسجيل كل نموذج ملف بالنقر فوق تسجيل البيانات في لوحة معلومات الاكتساب (سجل ما لا يقل عن 5,000 حدث لكل عينة).
   13. لكل عينة حبة مسجلة ، اضبط البوابات P2 و P3 على القمم الموجبة والسالبة ، على التوالي.
   14. قم بتشغيل عينات الخلايا للحصول على تعويض (راجع الخطوتين 4.2 و 4.4.7 والقسمين 5 و 6). قم بتعديل جهد FSC و SSC وقيمة العتبة لتصور الخلايا ، وضبط بوابة P1 ، وأخيرا تسجيل كل ملف عينة (سجل ما لا يقل عن 10,000 حدث). اضبط البوابات P2 و P3 على القمتين الإيجابية والسالبة ، على التوالي.
       ملاحظه: ولتعويض قناة Hoechst، استخدم G₀/G₁ باعتباره الذروة السالبة (P3) وG₂/M باعتباره الذروة الموجبة (P2).
   15. انقر فوق تجربة في قسم شريط مساحة العمل وفي قسم إعداد التعويض، حدد حساب التعويض.
   16. قم بتسمية إعداد التعويض الذي تم إنشاؤه والرابط واحفظه في التجربة الحالية.
2. الحصول على عينة تجريبية
   1. افتح عينة بالنقر فوق عينة جديدة على شريط أدوات المستعرض، وقم بإنشاء استراتيجية البوابة في ورقة العمل العالمية.
      ملاحظه: تشبه استراتيجية البوابات للحصول على العينات استراتيجية تحليل العينة ، الموضحة في الشكل 2 والقسم 9.
   2. عرض جميع مجموعات الأحداث في رسم بياني باستخدام CD3-A على المحور x. قم بإنشاء بوابة فاصل زمني لتحديد خلايا CD3⁺ فقط.
   3. في لوحة معلومات الاكتساب، حدد بوابة التخزين ككافة الأحداث لعينات LN، وإما جميع الأحداث أو خلايا CD3⁺ لعينات الطحال.
   4. قم بتشغيل العينات التجريبية بسرعة منخفضة ، وأخيرا قم بتسجيل جميع الملفات مع التأكد من جمع ما لا يقل عن 100-200 خلية CD8 T خاصة بالمستضد لكل عينة من الفئران الملقحة><. ملاحظه: عادة ما يكون حجم ملف العينات التجريبية كبيرا (30-120 ميجابايت) ، خاصة عندما يكون تواتر خلايا CD8 T الخاصة بالمستضد منخفضا. وبالتالي ، يجب جمع أعداد كبيرة من الأحداث (> 1 × 10⁶) لتسجيل ما لا يقل عن 100-200 خلية CD8 T الخاصة بالمستضد. قد تؤدي الملفات الكبيرة إلى إبطاء عملية تحليل البيانات اللاحقة. يعد الحصول على خلايا CD3+ فقط في عينات الطحال (انظر الخطوة 8.2.2 أعلاه) مفيدا في الحفاظ على حجم الملف أصغر.
   5. قم بتشغيل وتسجيل التحكم الإيجابي لتحليل دورة الخلية ، أي عينة BM من الفئران غير المعالجة.

< p class = "jove_title" >9. تحليل البيانات

1. افتح البرنامج (راجع جدول المواد) ، وقم بإنشاء مجموعات مختلفة تتوافق مع الأجهزة المختلفة المراد تحليلها بالنقر فوق إنشاء مجموعة في قسم شريط مساحة العمل (على سبيل المثال ، إنشاء مجموعة "a-LNs" ؛ "b-spleen" ؛ "c-BM").
   ملاحظه: ستظهر المجموعات التي تم إنشاؤها حديثا في قائمة المجموعات، بينما يتم إنشاء مجموعة "التعويض" تلقائيا بواسطة البرنامج.
2. افتح نافذة تعديل المجموعة بالنقر المزدوج فوق اسم المجموعة ، وتحقق من مزامنة المجموعات التي تم إنشاؤها حديثا. إذا لم يكن الأمر كذلك، فقم بإدراج علامة اختيار على الدالة Synchronized.
3. اسحب كل ملف .fcs في المجموعة المقابلة له.
4. قم بإنشاء استراتيجية البوابات بدءا من مجموعة "a-LNs".
5. انقر نقرا مزدوجا فوق العينة الملطخة بالكامل في المجموعة لفتح نافذة الرسم البياني ؛ يتم تسمية المحورين x و y كما في ملفات fcs (انظر إعدادات مقياس التدفق الخلوي ، الجدول 2).
6. اعرض إجمالي الأحداث المكتسبة لهذه العينة في مخطط نقطي مع DNA-A على المحور x و DNA-W على المحور y.
7. حدد فقط مجموعة الخلية المفردة بالنقر فوق مستطيل في قسم أداة البوابات في نافذة الرسم البياني.
   ملاحظه: تحتوي الخلايا المفردة على قيم DNA-A على النحو التالي: 2N (منخفض): بين 2N و 4N (متوسط) ، أو يساوي 4N (مرتفع) ، بينما قيم DNA-W متطابقة لكل منهم (الخطوة 1 من الشكل 2).
انقر
8. نقرا مزدوجا في وسط البوابة المستطيلة لعرض الخلايا المفردة في مخطط نقطي مع المعلمة FSC-A على المحور x وصبغة الخلية الميتة على المحور y.
9. حدد فقط مجموعة الخلايا الحية بالنقر فوق Polygon في قسم أداة البوابة في نافذة الرسم البياني. الخلايا الحية سالبة لصبغة الخلايا الميتة (الخطوة 2 من الشكل 2).
10. انقر نقرا مزدوجا في وسط البوابة متعددة الأضلاع لعرض الخلايا في مخطط نقطي مع المعلمة FSC-A على المحور x والمعلمة SSC-A على المحور y.
11. انقر فوق المستطيل ، وقم بإنشاء بوابة "مريحة" لتضمين جميع الخلايا الحية المفردة في هذا الرسم البياني (الخطوة 3 من الشكل 2).
12. انقر نقرا مزدوجا في وسط البوابة "المريحة" لعرض الخلايا في مخطط نقطي مع CD3 على المحور x و CD8 على المحور y.
13. حدد خلايا CD3 ⁺ CD8 ⁺ بالنقر فوق Polygon (الخطوة 4 من الشكل 2).
14. انقر نقرا مزدوجا في وسط بوابة CD3 ^{+ CD8 +} لعرض الخلايا في مخطط نقطي مع Tetr-gag على المحور x و Pent-gag على المحور y.
15. حدد خلايا CD8 T الخاصة بالمستضد (إيجابية لكل من Tetr-gag و Pent-gag) بالنقر فوق Polygon (الخطوة 5 من الشكل 2).
16. انقر نقرا مزدوجا في وسط البوابة الخاصة بكمامة لعرض الخلايا في مخطط نقطي مع DNA-A على المحور x و Ki67 على المحور y (الشكل 3).
17. حدد الخلايا في مراحل دورة الخلية المختلفة بالنقر فوق رباعية في قسم أداة البوابات في نافذة الرسم البياني.
    ملاحظه: الخلايا في مرحلة G₀ هي خلايا منخفضة Ki67neg-DNA (الربع الأيسر السفلي) ؛ الخلايا في G₁ هي Ki67pos-DNA منخفضة (الربع الأيسر العلوي) ؛ الخلايا الموجودة في S-G2 / M هي Ki67pos-DNA متوسطة / عالية (الربع العلوي الأيمن) (الشكل 3).
18. انسخ استراتيجية البوابات التي تم إنشاؤها في عينة واحدة إلى المجموعة المقابلة لتطبيق البوابات على جميع عينات المجموعة.
19. كرر الخطوات من 9.5 إلى 9.18 ل "مجموعة a-NN".
20. تأكد من أن جميع البوابات مناسبة لكل عينة من مجموعة "الطحال الب". لتحليل دورة الخلية بين خلايا BM (التحكم الإيجابي) ، انقر في وسط البوابة "المريحة" لعرض الخلايا في مخطط نقطي مع DNA-A على المحور x و Ki67 على المحور y.
21. تأكد من أن جميع البوابات مناسبة لكل عينة من المجموعات الثلاث (أي لخلايا الطحال و LN و BM).
    ملاحظه: قد يكون لبوابة خلية واحدة (الخطوة 9.7) والبوابة الرباعية لدورة الخلية (الخطوة 9.17) إحداثيات بوابة مختلفة في عينات مختلفة ، ويرجع ذلك أساسا إلى الاختلافات الطفيفة المحتملة في شدة صبغة Hoechst بين العينات (القسم 6.2). لهذا السبب ، قد يكون من الضروري تعديل بوابة السكان أحادية الخلية والبوابات الرباعية لدورة الخلية في كل عينة. سيتم ذلك على النحو التالي: انقر نقرا مزدوجا فوق اسم المجموعة ، وقم بإزالة المزامنة من خصائص المجموعة. تسمح هذه العملية بتعديل البوابات في عينة واحدة دون تعديل نفس البوابات في جميع العينات الأخرى للمجموعة. بعد إزالة المزامنة ، قم بتعديل البوابات عند الضرورة.
22. لتصور النتائج التي تم الحصول عليها من خلال هذا التحليل ، انقر فوق محرر التخطيط في قسم شريط مساحة العمل لفتحه. اسحب كل بوابة من بوابة استراتيجية البوابات في جزء العينة إلى محرر التخطيط ، وضع المخططات وفقا لتسلسل استراتيجية البوابات. إذا لزم الأمر ، قم بتغيير نوع الرسم البياني بالنقر المزدوج على المخطط المقابل في التخطيط وتحديد النوع المناسب في نافذة تعريف الرسم البياني.
23. انقر فوق المجموعة وكرر حسب الوظائف على شريط التخطيط لتصور النتائج التي تم الحصول عليها في كل عضو ، ومقارنة العينات المختلفة.

الجدول 1: إعدادات مقياس التدفق الخلوي.

عينة لوحة الأجسام المضادة ملطخ بالكامل كي 67 فيتك CD3 PercpCy5.5 Tetr-gag APC إف في دي إيفلور 780 هوشت: 33342 CD8 BUV805 Pent-gag PE Ki67 FMO CD3 PercpCy5.5 Tetr-gag APC إف في دي إيفلور 780 هوشت: 33342 CD8 BUV805 Pent-gag PE Tetr-gag APC FMO كي 67 فيتك CD3 PercpCy5.5 إف في دي إيفلور 780 هوشت: 33342 CD8 BUV805 Pent-gag PE خماة هفوة PE FMO كي 67 فيتك CD3 PercpCy5.5 Tetr-gag APC إف في دي إيفلور 780 هوشت: 33342 CD8 BUV805 CD8 FMO كي 67 فيتك CD3 PercpCy5.5 Tetr-gag APC إف في دي إيفلور 780 هوشت: 33342 Pent-gag PE CD3 FMO كي 67 فيتك Tetr-gag APC إف في دي إيفلور 780 هوشت: 33342 CD8 BUV805 Pent-gag PE صبغ الجدوى القابل للإصلاح FMO كي 67 فيتك CD3 PercpCy5.5 Tetr-gag APC هوشت: 33342 CD8 BUV805 Pent-gag PE Hoechst 33342 FMO كي 67 فيتك CD3 PercpCy5.5 Tetr-gag APC إف في دي إيفلور 780 CD8 BUV805 Pent-gag PE

الجدول 2: إعدادات مقياس التدفق الخلوي.

ماعون دينار بحريني LSR Fortessa ليزر أزرق 488 نانومتر أحمر 639 نانومتر UV 355nm أصفر / أخضر 561 نانومتر مرشحات ممر النطاق الترددي 530/30 710/50 670/14 780/60 530/30 820/60 585/15 780/60 مرشحات Longpass 505 ليرة بلور 685 ليرة بينية 750 ليرة بلور 505 ليرة بلور 770 ليرة بلور 750 ليرة بلور الفلوروكروم / الصبغة المستخدمة فيتك PERCPCY5.5 جنود الدربان إيفلور 780 هوشت: 33342 BUV805 PE بيسي7 الاسم المقابل في ملفات fcs أليكسا فلور 488 PERCPCY5.5 جنود الدربان APC-H7 Hoechst-Red BUV737 PE بيسي7

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تحليل دورة الخلية لخلايا BM. تم تلطيخ خلايا BM من فئران Balb / c غير المعالجة وتحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي. (أ) مثال على استراتيجية البوابات. قمنا ببوابات على خلايا مفردة في مخطط DNA-A / -W (يسار) وبعد ذلك على الخلايا الحية عن طريق استبعاد صبغة الخلايا الميتة (الوسط). بعد ذلك ، تم استخدام بوابة FSC-A / SSC-A "مريحة" لجميع خلايا BM (على اليمين). (ب) مثال على تحليل دورة الخلية...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1-200 ميكرولتر نصائح ماصة معبأة بالجملة كورنينج CLS4866-1000 إيه 2.4G2 مضاد ل FcγR mAb دينار بحريني 553141 10 ميكروغرام / مل التركيز النهائي 5 مل مغطس حقنة BD الزمرد 307733 15 مل أنابيب مخروطية الشكل ميرك ميليبور SBHA025SB طبق ثقافة الخلايا المعالج ب TC مقاس 60 مم صقر 353002 مصفاة خلية 70 ميكرومتر صقر 352097 96-well Clear جولة القاع TC المعالجة ثقافة Microplate صقر 353077 مضاد للجرذان / الهامستر Ig ، k / جزيئات تعويض التحكم السلبي BD- العلوم البيولوجية 552845 بيتا ميركابتو إيثانول سيغما م 3148 ألبومين مصل الأبقار سيغما أ 07030 BUV805 الفئران المضادة للفأر CD8a BD- العلوم البيولوجية 564920 4 ميكروغرام / مل التركيز النهائي محلول ملحي عازل للفوسفات من Dulbecco بدون كالسيوم بدون مغنيسيوم يوروكلون ECB4004L أنابيب القفل الآمن من Eppendorf ، 1.5 مل إيبندورف 30120159 ايثانول سيغما 34852-1L-م محلول ملح ثنائي الصوديوم حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) سيغما [إ7889] مصل الأبقار الجنينية كورنينج 35-079-السيرة الذاتية فيلكون ، معقم ، نوع الحقنة 70 ميكرومتر صقر هاتف: 352350 صبغة قابلة للإصلاح eFluor 780 العلوم البيولوجية الإلكترونية 65-0865-14 1: 1000 التركيز النهائي Foxp3 / مجموعة العازلة لتلطيخ عامل النسخ العلوم البيولوجية الإلكترونية 00-5523-00 تحتوي هذه المجموعة على تركيز التثبيت / النفاذية والمخفف ، ومخزن مؤقت للنفاذية 10x H-2k (d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC) المسمى رباعي مقدمة من مرفق المعاهد الوطنية للصحة Tetramer Core 6 ميكروغرام / مل التركيز النهائي H-2k (d) AMQMLKETI phycoerythrine (PE) المسمى خماسي Proimmune F176-2A-E - 176 10 ميكرولتر / عينة Hoechst 33342 ، ثلاثي هيدروكلوريد ، ثلاثي الهيدرات - محلول 10 مجم / مل في الماء ثيرموفيشر H3570 Ki-67 الجسم المضاد أحادي النسيلة (SolA15) ، FITC العلوم البيولوجية الإلكترونية 11-5698-82 5 ميكروغرام / مل التركيز النهائي L-Glutamine 100X (200 ملم) يوروكلون ECB3000D مرشحات Millex-HA 0,45 ميكرومتر دينار بحريني 340606 البنسلين / الستربتومايسين 100X يوروكلون ECB3001D PE / Cyanine7 المضاد للفأر CD62L الأجسام المضادة بيوليجند 104418 0.2 ميكروغرام / مل التركيز النهائي PerCP-Cy™5.5 الهامستر المضاد للفأر CD3e BD- العلوم البيولوجية 551163 4.4 ميكروغرام / مل التركيز النهائي عازلة تحلل خلايا الدم الحمراء سيغما R7757 أنابيب البوليسترين المستديرة القاع ، 5 مل صقر 352058 RPMI 1640 متوسط بدون L-Glutamine مع الفينول الأحمر يوروكلون ECB9006L حزمة برامج لتحليل بيانات قياس التدفق الخلوي فلولجو v.10 برنامج للحصول على العينات في مقياس التدفق BD FACSDiva الخامس 6.2 تريبان بلو سوليشن يوروكلون ECM0990D