مقايسة قياس التدفق الخلوي لتحديد المجموعات الفرعية للخلايا المناعية في خلايا الدم المحيطية أحادية النواة

الملخص

المصدر: Torchia ، M. L. G. ، وآخرون تمييز سبع مجموعات فرعية من الخلايا المناعية عن طريق قياس التدفق الخلوي ثنائي الفلوروكروم. J. Vis. Exp. (2019)

< p class = "jove_content">يوضح هذا الفيديو تقنية قائمة على قياس التدفق الخلوي باستخدام اثنين من الفلوروكرومات لتحديد الخلايا التائية CD4 ⁺ و CD8 ⁺ ، والخلايا التائية γδ ، والخلايا البائية ، والخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ، والخلايا الوحيدة في خلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة (PBMCs). عند احتضان الخلايا بالأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم ضد علامات السطح ، يتم تحديد المجموعات الفرعية للخلايا باستخدام استراتيجية بوابات التدفق الخلوي المثلى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

ملاحظة: تم اختبار هذا البروتوكول على خلايا الدم المحيطية المعزولة حديثا أو المجمدة والدم الكامل.

< ص الفئة = "jove_title" >1. تلطيخ الخلية

ملاحظة: يعد اختيار أزواج من الفلوروكروم بدون تداخل طيفي تقريبا أمرا مهما لتقليل انتشار البيانات بسبب الانتشار العالي للفلوروكروم في كاشف الفلوروكروم الآخر. لتحقيق التحديد الأمثل لجميع المجموعات الفرعية للخلايا ، يجب استخدام الفلوروكرومات ذات العائد الكمي العالي مثل أزواج الأجسام المضادة PE-BV421 و PE-APC.

1. تلطيخ PBMC الطازجة والمجمدة
   1. انقل 100 ميكرولتر من PBMC (1 × 10⁶ خلايا) إلى لوحة قاع V سعة 96 بئرا.
      ملاحظه: يمكن استخدام أي عدد من الخلايا أقل من 1 × 10⁶ بنتائج مماثلة.
   2. جهاز طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 3 دقائق في RT وشفط المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية. أضف إلى كل بئر 100 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) الذي يحتوي على صبغة حية / ميتة قابلة للإصلاح تتفاعل مع الأمين الحر على البروتينات لمدة 10 دقائق لتسمية الخلايا الميتة.
   3. استعد لكل عينة 30 ميكرولتر من مزيج يحتوي على جميع الأجسام المضادة (مضاد CD3. -CD56 ، TCRγδ في الفلوروكروم A ، ومضاد CD4 ، CD8 ، CD19 ، CD14 في الفلوروكروم B). يشار إلى تركيزات الأجسام المضادة في الجدول 1 والجدول 2. في هذه المرحلة ، يمكن إضافة الأجسام المضادة الممعايرة ضد جزيئات مستهدفة مختلفة وفي فلوروكرومات مختلفة أيضا (على سبيل المثال ، الجدول 3).
      ملاحظه: يمكن أن يختلف تركيز الأجسام المضادة حسب الشركة المصنعة ورقم الدفعة. لذلك ، يجب إجراء اختبارات أولية لتحقيق الإشارة المثلى. تم استخدام PBS و PBS / 0.5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ، PBS / 0.2٪ أزيد الصوديوم أو PBS / 0.5٪ BSA / 0.1٪ أزيد الصوديوم مع نتائج مماثلة لتخفيف الأجسام المضادة. يمكن أيضا تلطيخ الخلايا بأحجام مختلفة عن 30 ميكرولتر لدمج هذه المنهجية بسهولة في بروتوكولات التلوين الموجودة بالفعل.
   4. جهاز طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 3 دقائق في RT وشفط المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية. أضف كوكتيل الأجسام المضادة إلى كل بئر وأعد تعليقه بعناية دون توليد فقاعات. احتضن لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
      ملاحظه: من الممكن تلطيخ العينات عند 4 درجات مئوية بنتائج مماثلة.
   5. أضف 150 ميكرولتر من محلول التلوين والطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 3 دقائق في RT وشفط المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من PBS واحصل على بيانات على مقياس التدفق الخلوي. إذا تم تغيير أحجام التلوين ، فيرجى التأكد من تخفيف مزيج الأجسام المضادة الأصلي المستخدم لغسل الأجسام المضادة الزائدة بمقدار 20 ضعفا على ><الأقل. ملاحظه: يمكن تثبيت الخلايا الملطخة داخل PBS / 2٪ بارافورمالدهايد ، وحفظها في الثلاجة عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، ثم الحصول عليها على مقياس التدفق الخلوي في اليوم التالي.
      أنذر: بارافورمالدهيد ضار إذا ابتلع ويمكن أن يسبب تهيج الجلد

فئة

2. معايرة الأجسام المضادة

ملاحظة: تعد معايرة الأجسام المضادة هي الخطوة الأكثر أهمية للحصول على بيانات عالية الجودة وقابلة للتكرار. يتبع المعايرة بالتحليل الحجمي المضادة ل CD3 و -CD8 و -CD14 و -CD19 و -TCR γδ الإجراء القياسي الذي يتم من خلاله اشتقاق تركيز الجسم المضاد لفصل القمم الموجبة والسالبة على النحو الأمثل بواسطة الحد الأقصى لمؤشر التلوين. يجب تحديد التخفيفات في الذروة أو بالقرب من الذروة على الجانب الصاعد من منحنى مؤشر البقعة (الشكل 1A-C). يتم معايرة الجسم المضاد المضاد ل CD4 لوضع ذروة المجموعة الإيجابية CD4 بين مجموعات CD3 الإيجابية المفردة والخلايا التائية CD3 ^{+ /} CD8 ⁺ ، أقرب إلى إشارة CD3 الموجبة الأحادية للتمييز بشكل أفضل بين مجموعات CD8dim (خلايا CD8 ⁺ γδ T والخلايا التائية NK). على نفس المنوال ، يهدف المعايرة بالتحليل الحجمي CD56 إلى وضع خلايا NK CD56 ⁺ بين CD3 ⁺ ومجموعة CD3^.

1. الحد الأقصى لمؤشر البقعة
   ملاحظة: يتبع المعايرة بالتحليل الحجمي المضادة ل CD3 و -CD8 و -CD14 و -CD19 و -TCR γδ الإجراء القياسي الذي يتم من خلاله اشتقاق تركيز الجسم المضاد لفصل القمم الموجبة والسالبة على النحو الأمثل عن طريق منحنى مؤشر التلوين الأقصى. إذا تمت إضافة الأجسام المضادة ضد العلامات الأخرى إلى اللوحة ، فيجب أيضا معايرتها بأقصى منحنى مؤشر تلطيخ.
   1. قم بإعداد تخفيف الأجسام المضادة 2 ضعفا عن طريق ملء 10 آبار من صفيحة 96 بئرا ب 40 ميكرولتر من محلول التلوين. في البئر الأول ، قم بزيادة الحجم النهائي إلى 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلوين وأضف الجسم المضاد المعني بتركيز 4 أضعاف التركيز المقترح من قبل الشركة المصنعة.
   2. تخلط جيدا وتنقل 40 ميكرولتر إلى البئر الثاني. تخلط جيدا وكرر هذه الخطوة لجميع الآبار الأخرى.
   3. صبغ 10 عينات من PBMC أو الدم الكامل ب 30 ميكرولتر من 10 تخفيفات مختلفة من الأجسام المضادة باتباع البروتوكول الموصوف من قبل.
   4. احصل على البيانات باستخدام مقياس التدفق الخلوي وارسم الإشارة من كل تخفيف (الشكل 1 أ).
   5. بوابة على المجموعات السكانية السلبية والإيجابية لكل تركيز من تركيزات الجسم المضاد. يمكن أن تؤدي زيادة تركيز الأجسام المضادة إلى خلفية أعلى. لذلك ، قم بتغيير حجم البوابة السالبة وفقا لذلك.
   6. لكل تركيز للجسم المضاد ، استخرج معلومات حول المتوسط والانحراف المعياري لشدة الفلورسنت للسكان السلبين ، ومتوسط شدة الفلورسنت للسكان الإيجابيين. احسب لكل تركيز جسم مضاد مؤشر البقعة بهذه الصيغة: (متوسط شدة الفلورسنت للسكان الإيجابيين - متوسط شدة الفلورسنت للسكان السالب) ÷ (2 × الانحراف المعياري لشدة الفلورسنت للسكان السالب) (الشكل 1 ب).
   7. ارسم مؤشر البقع مقابل تركيز الجسم المضاد المعبر عنه كجزء من تخفيف الجسم المضاد (على سبيل المثال ، تخفيف 1:10 = 0.1) ، وحدد تركيز الجسم المضاد بأقصى قيمة لمؤشر البقعة (الشكل 1 ج).
2. معايرة الأجسام المضادة CD4 و -CD56
   ملاحظة: يعتمد معايرة الأجسام المضادة للCD4 و-CD56 على المعايرة بالتحليل الحجمي السابقة للعلامات الأخرى في لوحة الفلوروكروم ثنائي الفلور. بالنسبة للجسم المضاد ل CD4 ، يهدف المعايرة بالتحليل الحجمي إلى وضع الإشارة المضادة ل CD4 بين إشارة CD8 ^{+ /} CD3 ^{المزدوجة} والمجموعة الموجبة الموحدة CD3 (الشكل 1 د).
   1. قم بمعايرة الأجسام المضادة المضادة ل CD4 و CD56 باستراتيجية تخفيف من ضعفين كما هو موضح من قبل ، مع إضافة تركيزات إضافية بينهما لتحديد نطاق التركيز بدقة الذي يسمح بفصل الخلايا التائية CD4 ⁺ والخلايا الطبيعية عن مجموعات الخلايا الأخرى.
   2. قم بمعايرة الجسم المضاد ل CD4 عن طريق وضع إشارة مضادة ل CD4 بين إشارة CD8 ⁺ / CD3 ⁺ المزدوجة ومجموعة CD3 الموجبة المفردة (الشكل 1 د).
      ملاحظه: يجب توخي الحذر بشكل خاص لفصل خلايا CD4 ⁺ T بوضوح عن التجمعات الخافتة CD8 ⁺.
   3. قم بمعايرة الجسم المضاد المضاد ل CD56 باتباع استراتيجية مشابهة لمعايرة الأجسام المضادة ل CD4 ، عن طريق وضع الخلايا القاتلة الطبيعية بين المجموعات السكانية السلبية CD3 وإيجابية CD3.

< p class = "jove_title" >3. استراتيجية البوابات

1. تحديد مجموعات الخلايا الليمفاوية وحيدة الخلية وإزالة الخلايا الميتة ومعظم خلايا الدم الحمراء المتبقية من التحليل.
   1. حدد المجموعة الكاملة التي تحتوي على الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة بناء على منطقة التشتت الأمامية مقابل الجانب (FSC-A مقابل SSC-A). قم بإزالة مجاميع الخلايا من التحليل عبر ارتفاع التشتت الأمامي مقابل عرض الانتثار الأمامي (FSC-H مقابل FSC-W) وارتفاع المبعثر الجانبي مقابل عرض الانتثار الجانبي (SSC-H مقابل SSC-W).
   2. استخدم علامة تمييز حية/ميتة لاستبعاد الخلايا الميتة الإيجابية الساطعة وخلايا الدم الحمراء المتبقية من التحليل. بوابة على الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة بناء على ملامح FSC-A و SSC-A المختلفة.
2. استراتيجية بوابات ثنائية الفلوروكروم ذات سبع علامات لمجموعات الخلايا الليمفاوية.
   ملاحظه: ضمن المجموعة الفرعية الإيجابية CD3 ، يمكن فصل الخلايا التائية CD4 ⁺ و CD8 ⁺ و γδ باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف فقط CD4 و CD8 ومستقبلات γδ. بطريقة مماثلة ، ضمن المجموعة الفرعية السلبية CD3 ، يمكن تحديد الخلايا البائية والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا الوحيدة بشكل فريد باستخدام الأجسام المضادة ضد CD19 و CD56 و CD14 ، على التوالي.
   1. حدد بوابة الخلايا الليمفاوية وقم بإنشاء مخطط نقطي على كل محور واحد من اثنين من الفلوروكروم المستخدم في هذا البروتوكول (الشكل 2 ب).
   2. بوابة على خلايا CD8 ⁺ T تم تحديدها على أنها خلايا موجبة مزدوجة CD3 ^{+ /} CD8 ⁺ في الزاوية اليمنى العليا من مخطط النقطة (الشكل 2 ب). استبعاد مجموعة CD8 الخافتة التي قد تحتوي على خلايا NKT. بوابة على خلايا CD4 ⁺ T التي تم تحديدها على أنها مجموعة بين خلايا CD8 ⁺ T ومجموعات CD3 الإيجابية المفردة. بوابة على الخلايا التائية γδ تم تحديدها على أنها خلايا CD3 عالية. قسم الخلايا التائية في CD8 إيجابية و CD8 سلبية.
   3. بوابة على الخلايا القاتلة الطبيعية التي تم تحديدها على أنها مجموعة بين الخلايا الإيجابية CD3 و CD3 السلبية. قسم خلايا NK إلى CD8 إيجابية و CD8 سلبية. بوابة على الخلايا البائية التي تم تحديدها على أنها CD3 سلبية CD19 ⁺ في الزاوية السفلية اليمنى من المخطط النقطي.
   4. حدد بوابات الخلية الأحادية وقم بإنشاء مخطط نقطي على كل محور واحد من اثنين من الفلوروكروم المستخدم في هذا البروتوكول (الشكل 2 ج). بوابة على سكان CD3 / CD14 ⁺.

< p class = "jove_content" > الجدول 1: لوحة الأجسام المضادة المستخدمة في تلطيخ الخلايا المناعية ثنائية الفلور ل PBMC (تركيبة BV421-PE).

هدف استنساخ فلوروكروم بائع تركيز قصد CD3 UCHT1 هب ف421 دينار بحريني 1/20 النسب CD56 NCAM16.2 هب ف421 دينار بحريني 1/900 TCRγδ ب 1 هب ف421 الحيويه 1/30 CD4 RPA-T4 PE دينار بحريني 1/450 CD8 RPA-T8 PE دينار بحريني 1/20 CD14 م 5 إي 2 PE دينار بحريني 1/15 CD19 HIB19 PE دينار بحريني 1/300 الخلايا الميتة L / D أزرق الملازم 1/300 التمييز الأحياء / الميتات BD = BD Biosciences ، Bio = BioLegend ، LT = Life Technologies < p class = "jove_content" > الجدول 2: لوحة الأجسام المضادة المستخدمة في تلطيخ الخلايا المناعية ثنائية الفلور ل PBMC (تركيبة APC-PE).

هدف استنساخ فلوروكروم بائع تركيز قصد CD3 UCHT1 جنود الدربان دينار بحريني 1/20 النسب CD56 NCAM16.2 جنود الدربان دينار بحريني 1/60 TCRγδ ب 1 جنود الدربان الحيويه 1/30 CD4 RPA-T4 PE دينار بحريني 1/450 CD8 RPA-T8 PE دينار بحريني 1/20 CD14 م 5 إي 2 PE دينار بحريني 1/15 CD19 HIB19 PE دينار بحريني 1/300 الخلايا الميتة L / D أزرق الملازم 1/300 التمييز الأحياء / الميتات BD = BD Biosciences ، Bio = BioLegend ، LT = Life Technologies

الجدول 3: لوحة الأجسام المضادة المستخدمة لتلطيخ PBMC المجمدة من مريض مصاب بالورم النقوي المتعدد.

هدف استنساخ فلوروكروم كتالوج بائع تركيز قصد CD3 UCHT1 هب ف421 562426 دينار بحريني 1/20 النسب CD56 NCAM16.2 هب ف421 562751 دينار بحريني 1/900 TCRγδ ب 1 هب ف421 331217 الحيويه 1/30 CD4 RPA-T4 PE 555347 دينار بحريني 1/450 CD8 RPA-T8 PE 555367 دينار بحريني 1/20 CD14 م 5 إي 2 PE 555398 دينار بحريني 1/15 CD19 HIB19 PE 555413 دينار بحريني 1/300 CCR7 G043H7 AF647 353217 الحيويه 1/30 التمايز CD45RA مرحبا 100 APC-H7 560674 دينار بحريني 1/60 CCR4 1جي 1 PE-Cy7 561034 دينار بحريني 1/60 المجموعات الفرعية CCR6 G034-E3 BV605 353419 الحيويه 1/30 CXCR3 1C6 / CXCR3 أيه إف 488 561730 دينار بحريني 1/30 CD57 NK-1 PE-CF594 562488 دينار بحريني 1/900 التنشيط / الاستنفاد HLA-DR G46-6 BV510 563083 دينار بحريني 1/30 CD16 3جي 8 BUV395 563784 دينار بحريني 1/30 NK ، تنشيط الخلايا الأحادية الخلايا الميتة L / D أزرق L-23105 الملازم 1/300 التمييز الأحياء / الميتات

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: معايرة الأجسام المضادة التمثيلية. (أ) تظهر المخطط النقطي تعبير CD8 على PBMC الطازج الملطخ بالتركيز المشار إليه للجسم المضاد. (ب) يمثل الجدول المتوسط والانحراف المعياري لشدة الفلورسنت ل CD8 + ، ومتوسط كثافة الفلورسنت CD8- ، ومؤشر البقع المشتق لكل تركيز تم اختباره. (ج) يوضح الرسم البياني كيفية اشتقاق التركيز الأمثل للجسم المضاد كدال...

المواد