$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. الباركود لخلايا الدم المحللة / الثابتة
- قم بإذابة عينات الخلايا المحللة / الثابتة من التخزين -80 درجة مئوية ببطء على الجليد ؛ يمكن تمييز 20 عينة كحد أقصى برموز شريطية فريدة وتجميعها باستخدام هذا النظام. تمييع المخزن المؤقت لبيرم الترميز الشريطي 10X بمقدار 1:10 باستخدام PBS ؛ قم بعمل مخزن مؤقت كاف ل ~ 3 مل لكل عينة.
- املأ قاعا غير معقم ب CSM والآخر بمخزن مؤقت لتجعيد الترميز الشريطي 1X. أضف 1 مل من CSM المثلج إلى العينات المذابة حديثا ، واخلطها جيدا باستخدام ماصة ، وانقلها إلى أنابيب البولي بروبيلين العنقودية ذات العلامات المسماة مسبقا.
- خذ عينة سعة 10 ميكرولتر لحساب الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس كثافة الدم. قم بتطبيع عدد الخلايا إلى 1.5-2 × 106 خلايا لكل عينة في كل أنبوب عنقودي: قم بإزالة وتجاهل حجم الخلايا الزائدة فوق 2 × 106 خلايا.
- الطرد المركزي للخلايا عند 600 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت لبيرم الترميز الشريطي 1X باستخدام ماصة متعددة القنوات وجهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشق من المادة الطافية.
- قم بمحاذاة أنابيب الكتلة على حامل بنفس الترتيب كما هو موضح في مفتاح الرمز الشريطي بحيث يتطابق العينة مع الرمز الشريطي الخاص بها. أضف 800 ميكرولتر 1X من المخزن المؤقت لتجعيد الترميز الشريطي بواسطة ماصة متعددة القنوات إلى جميع العينات في الأنابيب العنقودية دون لمس حبيبات الخلية بأطراف الماصة (بدون خلط) لتقليل فقدان الخلايا. ضع الرف جانبا مع أنابيب العنقود.
- قم بإزالة شرائط أنبوب مجموعة الترميز الشريطي Pd 20-plex من -20 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتجعيد الترميز الشريطي 1X ، واخلطه جيدا ، وانقل 120 ميكرولتر من مزيج الباركود المعلق إلى عينات الخلايا المقابلة في الأنابيب العنقودية.
- امزج جيدا بواسطة ماصة متعددة القنوات حتى لا يكون هناك تلوث متبادل بين العينات المشفرة بشكل فردي. احتضان الأنابيب العنقودية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للرموز الشريطية بتسمية الخلايا.
- جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. شفط المادة الطافية ، ثم أعد تعليقها في 1 مل من السائل النخاعي النخاعي.
- جهاز طرد مركزي وإعادة تعليقه في CSM مرة أخرى.
ملاحظه: يتم الآن تصنيف كل عينة برمز شريطي فريد ، والعينات جاهزة للتجميع.
- جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وشفط المادة الطافية. باستخدام ماصة واحدة وباستخدام نفس الطرف ، انقل جميع كريات الخلايا في الحجم المتبقي ~ 70-80 ميكرولتر إلى أنبوب بوليسترين واحد. لا تقم بإخراج طرف الماصة. ضع الماصة المفردة جانبا بهذا الطرف.
- باستخدام ماصة متعددة القنوات وأطراف جديدة، أضف ~100 ميكرولتر CSM إلى كل أنبوب عنقودي أصلي لزيادة استرداد الخلية. باستخدام الماصة المفردة مع الطرف الذي تم وضعه جانبا ، انقل جميع كريات الخلايا في الحجم المتبقي ~ 100 ميكرولتر إلى نفس أنبوب البوليسترين.
- أضف CSM لأعلى أنبوب البوليسترين (~ 3 مل). عد وسجل رقم الخلية لمجموعة الباركود المجمعة. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وشفط المادة الطافية. تابع تلطيخ العينات المشفرة في نفس اليوم.
ملاحظة: من الطبيعي أن نتوقع ~ 20-30٪ فقدان الخلية في عملية الترميز الشريطي.
فئة
2. تلطيخ خلايا الدم المحللة / الثابتة المشفرة والتحضير للتحليل على أداة قياس الكتلة
الخلوية
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: كل عيار 1X من الأجسام المضادة الملطخة (1 ميكرولتر من الجسم المضاد لكل تفاعل تلطيخ 100 ميكرولتر) ، يمكن أن يلطخ عادة 3-4 × 10
6 خلايا. لذلك ، عندما يتم تجميع جميع العينات المشفرة في أنبوب واحد ، يجب زيادة كمية الجسم المضاد. إذا كانت 20 عينة مشفرة تصل إلى 30 × 10
6 خلايا ، ويمكن لكل عيار 1X أن يلطخ 3-4 × 10
6 خلايا ، فإن العينة المشفرة تتطلب فقط عيار 10X ، بدلا من تلطيخ كل عينة على حدة ، الأمر الذي يتطلب كمية 20X من الجسم المضاد (1X لكل أنبوب فردي). يجب معايرة تركيز الجسم المضاد لعدد الخلية بعناية لكل كوكتيل أجسام مضادة فردية (لم تتم مناقشته هنا).
- تلطيخ الخلايا باستخدام الأجسام المضادة (جدول المواد) لتلوين السطح وتحريض السيتوكين.
- اصنع كوكتيل تلطيخ السطح عن طريق حساب الكمية المراد إضافتها وحساب خطأ سحب العينة (على سبيل المثال، إذا تم تلطيخ 20 عينة مشفرة من 2 × 106 خلايا في كل عينة، يلزم وجود صبغة عيار 10X؛ لحسابات الحجم النهائي، عوض خطأ سحب العينات عن طريق عمل محلول تلطيخ نهائي 10.5X).
- أضف 10X من حجم تلطيخ السطح إلى حبيبات الخلية المشفرة. لتقليل فقدان الخلايا ، باستخدام نفس الطرف ، قم بخلط وقياس حجم البقع السطحية وكريات الخلايا.
- بناء على حجم الخلايا وكوكتيل التلوين ، أضف CSM إلى حجم التلوين النهائي البالغ 50 ميكرولتر لكل عدد من عينات الخلايا (على سبيل المثال ، إذا كنت تقوم بتشغيل مجموعة من 20 عينة ، فإن 50 ميكرولتر × 20 = 1 مل). احتضن لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. حرك العينة كل 15 دقيقة لتعزيز التلوين المتساوي.
- أثناء حضانة البقعة السطحية ، قم بإعداد المخزن المؤقت Perm / Wash (جدول المواد) عن طريق التخفيف 1:10 باستخدام ddH2O. قم بإعداد أحجام من 2 مل للنفاذية و 5 مل للغسيل. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية أو على الثلج.
- قم بتعبئة أنبوب تلطيخ السطح باستخدام CSM ، وجهاز الطرد المركزي عند 600 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. أعد تعليق العينة المشفرة في 2 مل من 4 درجات مئوية ، 1:10 تخفيف Perm / Wash Buffer. احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 20-30 دقيقة لاختراق الخلايا بالكامل.
- جهاز طرد مركزي عند 600 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وشفط المادة الطافية.
- بالنسبة للتلطيخ داخل الخلايا ، اتبع خطوات تلطيخ مماثلة (كما هو الحال بالنسبة للتلطيخ السطحي). ومع ذلك ، استخدم المخزن المؤقت Perm / Wash المخفف 4 °C و 1:10 بدلا من CSM لجعل حجم التلوين الكلي بحيث تظل الخلايا في بيئة نفاذية طوال فترة التلوين داخل الخلايا.
- أضف كوكتيل الأجسام المضادة داخل الخلايا إلى حبيبات الخلية الملطخة والمنفذة للسطح (الخطوات 2.1.2-2.1.7). ارفع إجمالي حجم التلوين إلى 50 ميكرولتر لكل عدد من عينات الخلايا. احتضن لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، قم بتقليب العينة كل 15 دقيقة لضمان تلطيخ متساو.
- أثناء التلوين داخل الخلايا ، قم بإعداد محلول intercalator: 900 ميكرولتر من PBS المصفى + 100 ميكرولتر من 16٪ PFA المصفى (التركيز النهائي ل 1.6٪ PFA) + 0.2 ميكرولتر من 500 ميكرومتر من صبغة intercalator (جدول المواد).
- قم بتعبئة حبيبات الخلية + كوكتيل الأجسام المضادة داخل الخلايا مع المخزن المؤقت البارد 1:10 بيرم / غسيل.
- جهاز طرد مركزي عند 600 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وشفط المادة الطافية. قم بإزالة أنبوب التلوين باستخدام CSM. عد رقم الخلية وتسجيله. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وشفط المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من محلول intercalator من الخطوة 4.9. احتضان لمدة 20 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة للقضم الكامل أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية (يمكن أن تبقى العينات في محلول intercalator عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل تشغيلها على أداة قياس الكتلة الخلوية).
- تحضير الخلايا لأداة قياس الكتلة الخلوية.
- قم بتغطية الأنبوب ب 3 مل من ddH2O المصفى ، وجهاز الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بتعليق الخلايا في 3 مل من ddH2O المصفى ، قم بتمرير هذا التعليق عبر مرشح 100 ميكرومتر لإزالة أي حطام أو مجاميع يمكن أن تسد أداة قياس الكتلة الخلوية.
- عد وتسجيل رقم الخلية بعد الترشيح. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية
- تحضير محلول حبة المعايرة (جدول المواد) عن طريق تخفيفه 1:10 في ddH2O.
- أعد تعليق الخلايا الملطخة في الحجم المطلوب من محلول حبة المعايرة المخفف 1:10 للوصول إلى تركيز خلية ~ 1 × 106 خلايا / مل
ملاحظه: بالنسبة ل CyTOF1 عند 45 ميكرولتر / دقيقة ، فإن الأمثل الموصى به هو 5 × 105 خلايا / مل ؛ بالنسبة إلى Helios عند 30 ميكرولتر / دقيقة ، 7.5 × 105 خلايا / مل.
- تابع تشغيل العينة على أداة قياس الكتلة الخلوية.