مقالة منهجية

استخدام مجسات التوتر القائمة على الحمض النووي لتقييم قوى المستقبلات التي تطبقها الخلايا المناعية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Ma ، R. et al. ، تحقيقات توتر الحمض النووي لرسم خريطة لقوى مستقبلات بيكونيوتون العابرة بواسطة الخلايا المناعية. J. Vis. Exp.(2021)

يوضح الفيديو طريقة لتقييم قوى المستقبلات التي تطبقها الخلايا المناعية باستخدام جزيئات الذهب النانوية المثبتة على البولي إيثيلين جلايكول ومجسات توتر دبوس الشعر في الحمض النووي. تؤدي تفاعلات الخلايا التائية الإيجابية CD8 إلى ظهور المسبار ، مما يؤدي إلى انبعاث مضان بينما يحافظ قفل الخيوط على الإشارة لتحديد القوى التي تطبقها الخلايا المناعية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. تحضير قليل النوكليوتيدات

  1. قم بإذابة الحمض النووي الريبي المنقوص للأكسجين (DNA) في الماء (مقاومة 18.2 MΩ ، تستخدم في جميع أنحاء البروتوكول بأكمله). دوامة وتدوير المحلول باستخدام جهاز طرد مركزي منضدي. اضبط حجم الماء بحيث يكون التركيز النهائي 1 ملليمتر. تحقق من صحة التركيز باستخدام مقياس الطيف الضوئي النانوي لقياس الامتصاص عند 260 نانومتر وتحديد التركيز النهائي بناء على معامل انقراض قليل النوكليوتيد. < / > ملاحظه: يحتوي خيط الترابط على تعديل في كل طرف ، 5 'أمين ، و 3' بيوتين ، ليقترن بالفلوروفور وتقديم الترابط الحيوي. يجب أن تترافق مجموعة الأمين في خيط الترابط مع الفلوروفور. تستخدم صبغة Cy3B لهذا الاقتران نظرا لسطوعها العالي وثباتها الضوئي ، ولكنها لا يتم تقديمها بشكل عام تجاريا وتتطلب اقتران داخلي. وفقا لذلك ، يصف القسم التالي الاقتران بين الأمينات وأصباغ إستر N-hydroxysuccinimide (NHS). بالنسبة للمستخدمين النهائيين الذين ليس لديهم إمكانية الوصول إلى المرافق أو الموارد لتعديل الحمض النووي ، يمكن بدلا من ذلك شراء الأحماض النووية المعدلة من بائعي تخليق الحمض النووي المخصصين الذين يقدمون أصباغ مشرقة وقابلة للضوء ، مثل عائلة أليكسا وأتو من الأصباغ.
  2. قم بإعداد 10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) و 1 M محاليل بيكربونات الصوديوم (NaHCO3). امزج 10 ميكرولتر من محلول خيوط ترابط أمين 1 ملي مولار (10 نانومول) مع 10 ميكرولتر من 10x PBS ، و 10 ميكرولتر من 1 M NaHCO3 ، و 60 ميكرولتر من H2O. قم بإذابة 50 ميكروغرام من Cy3B N-hydroxysuccinimide (NHS ester) في 10 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) مباشرة قبل الاستخدام وأضفه إلى الخليط للحصول على حجم تفاعل إجمالي يبلغ 100 ميكرولتر. أضف إستر Cy3B NHS آخر. اتركيه يتفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة أو 4 درجات مئوية طوال الليل.
  3. قم بإعداد حبلا قفل Atto647N عن طريق اقتران خيط قفل الأمين مع إستر Atto647N NHS. قم بإعداد محلول 10x PBS و 1 M NaHCO3. امزج 10 ميكرولتر من محلول حبلا قفل أمين 1 ملي مولار (10 نانومول) مع 10 ميكرولتر من 10x PBS ، و 10 ميكرولتر من 1 M NaHCO3 ، و 60 ميكرولتر من H2O. قم بإذابة 50 ميكروغرام من إستر Atto647N NHS في 10 ميكرولتر من DMSO مباشرة قبل الاستخدام وأضفه إلى الخليط للحصول على حجم تفاعل إجمالي يبلغ 100 ميكرولتر. أضف إستر Atto647N NHS أخيرا. اتركيه يتفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة أو 4 درجات مئوية طوال الليل.
  4. بعد التفاعلات ، قم بإزالة المنتجات الثانوية والصبغة الزائدة والأملاح عن طريق ترشيح هلام تحلية P2. قم بتخفيف خليط التفاعل باستخدام H2O إلى حجم إجمالي قدره 300 ميكرولتر ، وهو مناسب لخطوة تنقية الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) اللاحقة. أضف 650 ميكرولتر من هلام P2 الرطب إلى جهاز الطرد المركزي وقم بالدوران عند 18,000 × جم لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة السائل الموجود في الجزء السفلي من الجهاز ، وأضف خليط التفاعل إلى العمود الذي يحتوي على هلام P2 ، ثم قم بتدويرها عند 18,000 × جم لمدة دقيقة واحدة ، واجمع خليط التفاعل في الجزء السفلي من الجهاز. < / > ملاحظه: يجب ترطيب جل P2 قبل 4 ساعات على الأقل من الاستخدام مع H2O.
  5. قم بتنقية خليط التفاعل المحلى باستخدام HPLC باستخدام عمود C18 المخصص لتنقية قليل النوكليوتيدات ، مع المذيب A: 0.1 M ثلاثي إيثيل أمونيوم أسيتات (TEAA) في H2O و B: الأسيتونيتريل (ACN) كمرحلة متحركة لشطف التدرج الخطي 10-100٪ B على مدى 50 دقيقة بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة. اجمع المنتج الذي يحتوي على ذروة امتصاص للحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين ، والحمض النووي (260 نانومتر) ، وذروة امتصاص للفلوروفور (560 نانومتر ل Cy3B و 647 نانومتر ل Atto647N) وجففها في مكثف طرد مركزي فراغ طوال الليل (انظر الشكل 1 أ).
  6. أعد تكوين منتج صبغة oligo المجففة في 100 ميكرولتر ماء. حدد تركيز حبلا الترابط Cy3B وخيط قفل Atto647N باستخدام مقياس الطيف الضوئي النانوي. تأكد من أن نسبة وضع العلامات على الصبغة قريبة من 1: 1. صحيح لامتصاص 260 نانومتر للصبغة إذا لزم الأمر عند تحديد تركيز قليل النوكليوتيدات.
  7. التحقق من صحة المنتج المنقى باستخدام التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة - وقت قياس الطيف الكتلي للطيران (MALDI-TOF-MS) باستخدام 3-Hydroxypropionaldehyde (3-HPA) كركيزة في 50٪ ACN / H2O مع 0.1٪ حمض ثلاثي فلور أسيتيك (TFA) و 5 مجم / مل سترات الأمونيوم باستخدام 0.5 ميكرولتر من المنتج عند 1-5 ميكرومتر لتحضير عينة MALDI-TOF-MS. يمكن العثور على مثال على الطيف الكتلي في الشكل 1 ب.
  8. قم بإذابة خصلة دبوس الشعر وخصلة مرساة التبريد في الماء وتأكد من أن تركيز محاليل المخزون يتراوح بين 50 و 100 ميكرومتر><. ملاحظه: خصلة دبوس الشعر غير معدلة ويمكن تصنيعها بشكل مخصص مباشرة من البائع. يحتوي حبلا المرساة على مجموعة تثبيت ثيول ومروي BHQ2 ويمكن تصنيعه بشكل مخصص مباشرة من البائع.
  9. Aliquot كل قليل النوكليوتيدات. للاستخدام والتخزين على المدى القصير ، قم بتخزين هذه قليل النوكليوتيدات عند 4 درجات مئوية. للتخزين طويل الأجل ، قم بتجميدها والاحتفاظ بها عند -20 درجة مئوية. في هذه المرحلة ، تكون جميع قليل النوكليوتيدات جاهزة لتجميع مسبار توتر الحمض النووي.
    ملاحظه: دورات التجميد والذوبان المتكررة ليست مشكلة بالنسبة لقليل النوكليوتيدات.
< p class = "jove_title" >2. تحضير السطح

< p class = "jove_content" >ملاحظة: يستغرق تحضير ركائز مسبار توتر دبوس الشعر الحمض النووي يومين. سيتم تشغيل مسبار توتر دبوس الشعر الحمض النووي على أغطية زجاجية.

  1. اليوم 1
    1. ضع الغطاء مقاس 25 مم على رف بولي تترافلورو إيثيلين في دورق سعة 50 مل. يمكن أن يستوعب كل رف ما يصل إلى 8 أغطية. اشطف الأغطية عن طريق غمرها في الماء ثلاث مرات.
    2. أضف 40 مل من محلول الإيثانول الممزوج بالماء بنسبة 1: 1 (v: v) إلى الدورق الذي يحتوي على الرف والأغطية ، وأغلق الدورق باستخدام فيلم البارافين.
    3. قم بتقطيع الدورق لمدة 15 دقيقة في منظف بالموجات فوق الصوتية (تردد التشغيل 35 كيلو هرتز) لتنظيف الغطاء. بعد الصوتنة ، تخلص من السائل واشطف الدورق بالرف وقم بغطيته بالماء 6 مرات على الأقل لإزالة أي مذيب عضوي متبقي.
    4. تحضير محلول سمكة الضاري المفترسة الطازج عن طريق خلط حمض الكبريتيك وبيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3: 1. لصنع 40 مل من محلول سمكة الضاري المفترسة ، أضف 30 مل من حمض الكبريتيك إلى دورق نظيف سعة 50 مل أولا ثم أضف ببطء 10 مل من بيروكسيد الهيدروجين ، H2O2. سوف يسخن محلول سمكة البيرانا بسرعة وينفجر بسرعة عند إضافة H2O2. اخلطي سمكة البيرانا برفق باستخدام طرف ماصة زجاجية.
    5. بعد ذلك ، انقل الرف الذي يحمل الغطاء إلى الدورق الذي يحتوي على محلول سمكة بيرانا مختلطة برفق للنقش (الشكل 2 أ). اسمح لمحلول سمكة البيرانا بالهيدروكسيل وتنظيف الأغطية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد حفر سمكة البيرانا ، انقل الرف باستخدام ملاقط فولاذية أو بولي تترافلورو إيثيلين إلى دورق نظيف سعة 50 مل بالماء واشطفه مرة أخرى بالماء 6 مرات على الأقل.
      أنذر: يمكن أن تتفاعل كميات كبيرة من المواد العضوية بقوة مع محلول سمكة الضاري المفترسة وقد تسبب انفجارا. كن حذرا واعمل دائما مع محلول سمكة البيرانا في غطاء الدخان. تأكد من ارتداء معطف المختبر والقفازات ونظارات السلامة. لا تقم أبدا بتخزين محلول سمكة المفترسة الطازجة في حاوية محكمة الغلق.
      ملاحظه: يجب أن تبقى نسبة بيروكسيد الهيدروجين إلى حمض الكبريتيك أقل من 1: 2 (v: v) ويجب ألا تتجاوز أبدا 1: 1. عند غمر الرف بأغطية في محلول سمكة البيرانا ، ضعها في المحلول ببطء وحذر. لا تتخلص من المحلول مباشرة بعد الحفر ، لأنه لا يزال نشطا وساخنا. اتركه في الدورق طوال الليل قبل سكبه في حاوية النفايات الحمضية.
    6. اغمر الرف الذي يحمل الغطاء في دورق سعة 50 مل مع 40 مل من الإيثانول لإزالة الماء. تخلص من الإيثانول وكرر 3 مرات للتأكد من إزالة الماء.
    7. ثم اغمر الرف في 3٪ أمينوبروبيل ثلاثي الإيثوكسي سيلان (APTES) (v / v) في 40 مل من الإيثانول للتفاعل مع -OH على الغطاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2 ب).
      ملاحظه: يمكن استبدال الإيثانول بالأسيتون.
    8. اشطف الأسطح 6 مرات عن طريق غمرها في 40 مل من الإيثانول ، ثم جففها في الفرن على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد التبريد ، قم بتخزين أغطية الغطاء المجففة المعدلة بالأمين عند -20 درجة مئوية للاستخدام المستقبلي (حتى 6 أشهر).
    9. قم بتغطية الجانب الداخلي السفلي لأطباق بتري البلاستيكية بقطر 10 سم بغشاء البارافين. يمنع فيلم البارافين الغطاء من الانزلاق داخل طبق بتري ويساعد في الحفاظ على المحلول للخطوات التالية من الوظيفة على الغطاء. ضع الغطاء المبرد المعدل بالأمين في أطباق بتري. يجب أن يكون الجانب المراد تشغيله متجها لأعلى.
    10. لتعديل مجموعات الأمين على الأغلفة ، أضف 300 ميكرولتر من 0.5٪ وزن / حجم حمض ليبويك بولي (إيثيلين جلايكول) (PEG) NHS (LA-PEG-SC) و 2.5٪ وزن / حجم mPEG NHS (mPEG-SC) في 0.1 M NaHCO3 على كل غطاء واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2 ج). لكل غطاء 25 مم ، تزن 1.5 مجم من LA-PEG-SC و 7.5 مجم من mPEG-SC. قم بإذابة كواشف NHS مباشرة قبل إضافتها إلى الأسطح ، حيث أن لها عمر نصف قصير (~ 10 دقائق) في محلول مائي في درجة حرارة الغرفة. بعد التفاعل ، اشطف الأسطح 3 مرات بالماء.
      ملاحظه: يمكن إجراء تفاعل NHS عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تتمتع كواشف NHS بعمر نصف أطول قبل التحلل المائي عند 4 درجات مئوية ، أي حوالي 4-6 ساعات. سيؤدي ذلك إلى إجراء إعداد السطح لمدة ثلاثة أيام.
    11. أضف 100 ميكرولتر من بيكربونات الصوديوم 0.1 M ، NaHCO3 يحتوي على 1 مجم / مل من أسيتات السلفو-NHS إلى مجموعة من أغطية "الساندويتش" (غطيتان متجهان تجاه بعضهما البعض مع وجود عازلة تفاعل بينهما). اسمح للتخميل لمدة 30 دقيقة على الأقل. لحفظ الكاشف ، يمكن القيام بهذه الخطوة باستخدام 50 ميكرولتر من 1 مجم / مل سلفو NHS أسيتات. اشطفه بالماء ثلاث مرات بعد التخميل.
    12. أضف 0.5 مل من جزيئات الذهب النانوية (AuNP ، 8.8 نانومتر ، حمض التانيك ، 0.05 مجم / مل) إلى كل غطاء واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2 د). لحفظ الكاشف ، يمكن القيام بهذه الخطوة عن طريق وضع غطاءين أيضا. تأكد من عدم وجود أملاح في النظام من الخطوات السابقة لتجنب تراكم جزيئات الذهب النانوية. لا تترك الأغطية حتى تجف بعد هذه الخطوة.
    13. وفي الوقت نفسه ، قم بالتهجين المسبق 4.7 pN دبوس شعر ، وخيط ترابط Cy3B ، وخيط مرساة BHQ2 الذي يشكل مجسات توتر الحمض النووي بنسبة 1.1: 1: 1 في 1 M كلوريد الصوديوم (NaCl) عند 300 نانومتر في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بتلدين الخيوط عن طريق تسخين المحلول حتى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم تبرد تدريجيا عن طريق خفض درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية على مدار 30 دقيقة في دورة حرارية.
    14. اشطف الغطاء بالماء ثلاث مرات بعد 30 دقيقة من الحضانة بجزيئات الذهب النانوية. أضف حبلا مرساة BHQ2 إضافيا (من مخزون 100 ميكرومتر) إلى محلول الحمض النووي الملدن لجعل النسبة بين حبلا المرساة BHQ2 وخيط الترابط Cy3B 10: 1. في هذه المرحلة ، يجب أن يحتوي محلول الحمض النووي على 300 نانومتر من بناء مسبار التوتر و 2.7 ميكرومتر BHQ2 حبلا . أضف 100 ميكرولتر لكل غطاءين لعمل "الساندويتش" (الشكل 2 ه).
    15. ضع كرة مناديل مختبر مبللة بحذر في طبق بتري (بعيدا عن أغطية) وأغلق الطبق بغشاء البارافين لمنع المحلول من الجفاف. غطي الطبق بورق القصدير واحتضنه على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
  2. اليوم 2
    1. اغسل المجسات الزائدة من الأغطية باستخدام 1x PBS. تحقق من جودة سطح مسبار توتر الحمض النووي تحت مجهر epifluorescent.
    2. قم بإعداد 40 ميكروغرام / مل من الستربتافيدين في 1x PBS واحتضانها على أغطية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2F). عادة ما يكون 100 ميكرولتر كافيا لغطاء 25 مم. اشطفه باستخدام PBS 3 مرات بعد الحضانة لغسل الكمية الزائدة من الستربتافيدين.
    3. تحضير 40 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة / الترابط البيوتيني في 1x PBS. أضف 50-100 ميكرولتر لكل شطيرة واحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2 ز). اشطفه باستخدام PBS ثلاث مرات بعد الحضانة لغسل الكمية الزائدة من الأجسام المضادة / الترابط الحيوي.
    4. قم بتجميع غرف التصوير النظيفة مع الأسطح بعناية. يمكن أن تتشقق الأسطح بسهولة عند شد الغرف. أضف 0.5-1 مل من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) إلى غرف التصوير واحتفظ بها جاهزة للتصوير بالخلايا (الشكل 2H).
< p class = "jove_title" >3. تصوير قوى مستقبلات الخلايا

  1. تحضير الخلايا المناعية ذات الأهمية في HBSS عند 1-2 × 106 خلايا / مل
    ملاحظه: تستخدم الخلايا الساذجة OT-1 CD8 + كمثال في هذه الورقة. قم بتنقية الخلايا التائية الساذجة OT-1 CD8 + من طحال الفئران المضحى بها باستخدام مجموعة عزل الخلايا التائية CD8 + الماوس MACS مع فاصل فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS) باتباع تعليمات الشركة المصنعة. عزل وإثراء الخلايا التائية CD8 + عن طريق إزالة أي خلايا تائية غير CD8 + ترتبط بها كوكتيل الأجسام المضادة المستنفدة للمغناطيسية. قم بتعليق الخلايا التائية الساذجة OT-1 CD8 + المنقاة في HBSS بمعدل 2 × 106 خلايا / مل واحتفظ بها على الثلج قبل الاستخدام.
  2. تحقق من جودة سطح مسبار توتر دبوس الشعر في الحمض النووي تحت المجهر الفلوري (هدف 100x) لمراقبة الجودة قبل إضافة الروابط أو خلايا الطلاء. قم بتصوير وتحديد متوسط شدة الخلفية في قناة Cy3B لسطح مسبار توتر دبوس الشعر من 5 مواضع مختلفة على الأقل و 3 تكرارات. حافظ على اتساق شروط الحصول على التصوير بحيث يمكن استخدام هذه القيمة كعلامة موثوقة لجودة السطح وكثافة المسبار (الشكل 3C).
    ملاحظه: حدد عدد خيوط الحمض النووي لكل جسيم نانوي ذهبي وعدد الجسيمات النانوية الذهبية لكل ميكرومتر2 في المرات القليلة الأولى من تحضير السطح وفقا للأدبيات ، والتي يمكن استخدامها كعلامة أخرى موثوقة لجودة السطح.
  3. لوحة ~ 4 × 104 - 10 × 104 خلايا على كل مسبار توتر الحمض النووي تعمل على غطاء الغطاء وتسمح لها بالالتصاق والانتشار لمدة ~ 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. عندما يتم طلاء الخلايا على مجسات شد دبوس شعر الحمض النووي وتبدأ في الانتشار ، قم بتصوير إشارات التألق التي يتم إنشاؤها في قناة Cy3B بهدف 100x (الشكل 2I).
  5. بعد أن تبدأ الخلايا في إنتاج إشارة توتر في الوقت الفعلي على سطح مسبار توتر دبوس الشعر في الحمض النووي في قناة Cy3B ، احصل على صور في كل من قنوات Cy3B و Atto647N (يعطي الفحص المجهري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) نسبة إشارة إلى ضوضاء أفضل من التألق السطحي). بعد ذلك ، أضف خيط Atto647N إلى غرف التصوير بتركيز نهائي يبلغ 200 نانومتر للتهجين الانتقائي ميكانيكيا.
  6. بعد 10 دقائق من الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت الذي يحتوي على خيط قفل Atto647N الفلوري بسرعة وبلطف واستبدله بأملاح هانك المتوازنة الطازجة. الصورة في كل من قنوات Cy3B و Atto647N مرة أخرى وتحديد معامل ارتباط Pearson مع برنامج Fiji.
  7. في نقطة الاهتمام للتحقيق ، أدخل خيط قفل غير فلوري للخلايا الموجودة في غرفة التصوير لتخزين إشارة التوتر. قم بإعداد مخزون خيوط القفل (100 ميكرومتر) وأضفه إلى الخلايا بتركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر. يمكن أن تختلف مدة القفل ولكن 10 دقائق هي الوقت الموصى به.
  8. احصل على أفلام بفاصل زمني أو صور نقطة النهاية في التألق لكل من رسم خرائط التوتر النوعي والتحليل الكمي حسب الحاجة (الشكل 2J والشكل 4).
    ملاحظه: إذا كان قياس التوتر في نقاط زمنية متعددة مطلوبا ، فابدأ في محو إشارات التوتر المخزنة عن طريق إضافة خيط مفتوح. لتجنب الشطف الزائد ، يتم استخدام تركيز نهائي أعلى لخيط فتح الفتح عند 2 ميكرومتر لبدء تفاعل إزاحة الخيط بوساطة إصبع القدم مع حبلا القفل لمدة 3 دقائق ، مما يؤدي إلى محو الإشارات المخزنة (الشكل 2J). اشطف قليل النوكليوتيدات الزائدة برفق باستخدام HBSS. سطح مسبار توتر دبوس الشعر للحمض النووي والخلايا جاهزة لجولة أخرى من تخزين التوتر ورسم الخرائط. فتح إشارات التوتر ليس ضروريا إذا كانت نقطة زمنية واحدة فقط ذات أهمية في الدراسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: أمثلة على تحضير قليل النوكليوتيدات.(أ) كروماتوجرام HPLC لتنقية حبلا ترابط Cy3B ؛ (ب) أطياف MALDI-TOF-MS للمنتج؛ (ج) جدول الكتلة المحسوبة والقمم المضروبة للمادة الأولية وقليل النوكليوتيدات المسمى.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 3-حمض هيدروكسي بيكولينيك (3-HPA) سيغما 56197 مصفوفة Maldi-TOF-MS إم بيج-SC بيوكيمبيج MF001023-2 كيلو إعداد السطح (3-أمينوبروبيل) ثلاثي إيثوكسيسيلان أكروس AC430941000 إعداد السطح 10x عازلة تحلل خلايا الدم الحمراء بيوليجند 00-4333-57 مخزن مؤقت 8.8 نانومتر من جزيئات الذهب النانوية ، حمض التانيك نانوكومبوسيكس ترتيب مخصص إعداد السطح Atto647N إستر NHS سيغما 18373-1 ملغ إف الفلوروفور ، أوليغو الإعدادية غرفة الخلية الفلورية ، للفحص المجهري ثيرمو فيشر العلمي أ 7816 التصوير محاقن BD فقط مع Luer-Lok BD العلوم الحيوية 309657 خلايا البيوتينيل المضاد للفأر CD3e العلوم الحيوية 13-0031-82 الجسم المضاد / الترابط البيوتينيل pMHC ovalbumin (SIINFEKL) مرفق المعاهد الوطنية للصحة Tetramer الأساسي في جامعة إيموري غير أ الجسم المضاد / الترابط ألبومين مصل الأبقار سيغما 735078001 حظر التفاعلات غير المحددة مصافي الخلايا بيولوجيكس 15-1100 خلايا رف صغير Coverslip ، تفلون ثيرمو فيشر العلمي ج 14784 إعداد السطح إستر Cy3B NHS جنرال إلكتريك للرعاية الصحية PA63101 الفلوروفور ، أوليغو الإعدادية محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) كورنينج 21-031 سم مخزن مؤقت ايثانول سيغما 459836 إعداد السطح أملاح هانك المتوازنة (HBSS) سيغما H8264 مخزن مؤقت بيروكسيد الهيدروجين سيغما H1009 إعداد السطح لا - بيج - SC بيوكيمبيج HE039023-3.4 كيلو إعداد السطح مجموعة بدء تشغيل Midi MACS (LS) ميلتيني بيوتيك 130-042-301 خلايا طقم عزل الخلايا التائية CD8 + T للماوس ميلتيني بيوتيك 130-104-075 خلايا أجهزة الطرد المركزي Nanosep MF مختبر بال ODM02C35 أوليغو الإعدادية رقم 2 أغطية زجاجية مستديرة VWR 48382-085 إعداد السطح NTA-SAM دوجيندو للتقنيات الجزيئية N475-10 إعداد السطح جل P2 بيو راد 1504118 أوليغو الإعدادية حامض الكبريتيك شركة EMD Millipore SX1244-6 إعداد السطح سلفو NHS أسيتات ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 26777 إعداد السطح معدات عمود Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 ، 4.6 × 150 مم ، 2.7 ميكرومتر 653950-702 تحضير قليل النوكليوتيدات نظام تنقية المياه Barnstead Nanopure ثيرمو فيشر الماء CFI Apo 100× NA 1.49 الهدف نيكون مجهريه مكعب Cy5 صفاء مجهريه تطوير جهاز اقتران شحنة مضاعفة الإلكترون (EMCCD) القياسات الضوئية مجهريه كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء أجيلينت 1100 تحضير قليل النوكليوتيدات مصدر التألق الشديد نيكون مجهريه مطياف الكتلة بالليزر بمساعدة المصفوفة للامتصاص/التأين لوقت الرحلة (MALDI-TOF-MS) فوياجر إس تي آر تحضير قليل النوكليوتيدات مقياس الطيف الضوئي Nanodrop 2000 UV-Vis ثيرمو فيشر تحضير قليل النوكليوتيدات نيكون Eclipse Ti مجهر مقلوب نيكون مجهريه نظام التركيز المثالي من نيكون نيكون مجهريه برنامج NIS Elements نيكون مجهريه مكعب رباعي النطاق TIRF 405/488/561/647 صفاء مجهريه مكعب RICM صفاء مجهريه قاذفة TIRF بقوة 488 نانومتر (50 ميجاوات) و 561 نانومتر (50 ميجاوات) و 640 نانومتر متماسك مجهريه مكعب TRITC صفاء مجهريه اسم أوليغو تعديل 5 '/ 3' تعديل التسلسل (5 إلى 3) استخدام 15mer أمين قفل حبلا تعديل 5 ': لا يوجد تعديل
تعديل 3 بوصات: / 3AmMO / AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TAC TA قفل إشارة التوتر في الوقت الحقيقي 15mer Atto647N قفل حبلا تعديل 5 بوصات: Atto647N
تعديل 3 بوصات: / 3AmMO / AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TAC TA قفل إشارة التوتر في الوقت الحقيقي 15mer حبلا قفل غير فلوري تعديل 5 ': لا يوجد تعديل
3 'تعديل: لا يوجد تعديل A AAA AAC ATT TAT AC قفل إشارة التوتر في الوقت الفعلي للتحليل الكمي 4.7 pN حبلا دبوس الشعر تعديل 5 ': لا يوجد تعديل
3 'تعديل: لا يوجد تعديل GTGAAATACCGCACAGATGCGT
TTGTATAAATGTTTTTTTTTTTTTTT
ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC
CAGC مسبار دبوس الشعر حبلا أمين ليجند تعديل 5 بوصات: / 5AmMC6 /
تعديل 3 بوصات: / 3Bio / CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT TTT مسبار دبوس الشعر BHQ2 مرساة حبلا تعديل 5 بوصات: / 5ThiolMC6-D /
تعديل 3 بوصات: / 3BHQ_2 / TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT مسبار دبوس الشعر حبلا Cy3B ligand تعديل 5 بوصات: Cy3B
تعديل 3 بوصات: / 3Bio / CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT TTT مسبار دبوس الشعر فتح حبلا تعديل 5 ': لا يوجد تعديل
3 'تعديل: لا يوجد تعديل العلامة GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT T T C فتح إشارة التوتر المتراكمة

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD8

مقالات ذات صلة