اختبار قائم على CFSE لمراقبة هجرة الخلايا المتغصنة للجلد إلى تصريف الغدد الليمفاوية في الفئران المصابة

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Bollampalli ، V. P. ، et al. اختبار قائم على CFSE لدراسة هجرة الخلايا المتغصنة لجلد الفئران إلى تصريف الغدد الليمفاوية أثناء الإصابة بالمتفطرة bovis Bacille Calmette-Guérin. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو فحصا لمراقبة هجرة الخلايا المتغصنة بعد إصابة وسادة القدم بالمتفطرة ب Bacille Calmette-Guérin BCG في الفئران. عند العدوى البكتيرية ، يتم تمييز خلايا التيار المستمر للجلد المنشطة بصبغة كربوكسي فلوريستين ثنائي أسيتات إستر السكسينيميديل (CFSE) القابلة للنفاذية للخلية. بعد فترة زمنية مناسبة لترحيل التيار المستمر إلى العقدة الليمفاوية المأبضية ، يتم عزل خلايا العقدة وتعريضها للتلوين المناعي لعلامات السطح الخاصة بالتيار المستمر. يتم تحديد DCs المهاجرة باستخدام قياس التدفق الخلوي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. إعداد مخزونات CFSE وتخزينها

1. تحضير مخزون 5 ملي مولار من 5 و 6 كربوكسي فلوريسين ثنائي أسيتات السكسينيميديل إستر (CFSE) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد. دوار. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من الحصص في أنابيب دقيقة معقمة بغطاء لولبي سعة 0.5 مل. قم بتخزين الحصص عند -80 درجة مئوية.

< ص الفئة = "jove_title" >2. الفئران

1. استخدم الفئران من الذكور أو الإناث الفطرية بين 8 و 12 أسبوعا من العمر. يفضل المطابقة للجنس والعمر. تأكد من وجود التصاريح الأخلاقية اللازمة للحيوانات قبل بدء التجارب.

فئة

3. تجميد بتخدير غاز الأيزوفلوران

1. قم بتحميل وحدة التخدير بالأيزوفلوران. املأ المحقنة الزجاجية محكمة الغلق بالغاز سعة 10 مل بالأيزوفلوران. تجنب إدخال فقاعات الهواء. قم بتوصيل المحقنة ومدخل السائل بالأنبوب المرفق وحرك الدافع للأمام حتى يكون السائل الموجود في أنبوب التوصيل على وشك الدخول إلى المرذاذ.
   ملاحظه: لا تقم بتخزين الأيزوفلوران في المحقنة عندما لا تكون قيد الاستخدام.
2. تخدير باستخدام الأيزوفلوران في غرفة الحث ، مع الحفاظ على تدفق الهواء عند حوالي 400 - 500 مل / دقيقة وتركيز الأيزوفلوران عند 3.5٪ .
   ملاحظه: لن تعمل الوحدة بدون تدفق الهواء.
3. بمجرد أن تنام ، أدر محبس الموجود على وحدة التخدير لتوجيه غاز الأيزوفلوران إلى قطعة القناع. تأكد من أن قطعة القناع سليمة لتجنب تسرب الغاز. يمكن الحفاظ على تدفق الهواء عند 400 مل / دقيقة ، بدلا من ذلك يتم تخفيضه إلى 200 مل / دقيقة. تقليل تركيز الأيزوفلوران إلى 2.6٪ .
   ملاحظه: يمكن زيادة تأثير التخدير و / أو تقليله عن طريق ضبط معدل التدفق.

فئة < ص = "jove_title" >4. حقن BCG والتعافي

1. قم بتأكيد وإجراء اختبارات بصريا مثل اختبار انعكاس قرصة إصبع القدم للتأكد من أن الفئران مشمولة / نائمة على قطعة قناع الأيزوفلوران قبل إجراء الحقن.
2. تلقيح في وسادة القدم الخلفية ، 1 × 10⁶ وحدات تشكيل مستعمرة من المتفطرة بوفيس باسيل كالميت-غيرين (BCG) في 30 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) باستخدام حقنة مزودة بإبرة 29 جم × 1/2 بوصة.< br / > ملاحظه: تم وصف توليد مخزونات البكتيريا الفطرية بإيجاز في الوصف الأصلي لهذا الإجراء ، وبتفصيل كبير في مكان آخر. BCG متاح بسهولة أيضا من المصادر التجارية. يوصي المؤلفون بأن يتم صوتنة BCG بالنبض أو تمريرها عبر حقنة لتعطيل الكتل قبل تلقيحها في الفئران. يتم التأكيد هنا على BCG كمحفز ميكروبي نظرا لاستخدامه في الوصف الأصلي لهذا البروتوكول 3 ، لكن المؤلفين يشجعون بالتأكيد على اختبار المحفزات الميكروبية الأخرى.
3. قم بتنفيذ نفس الإجراء الموضح أعلاه لحقن PBS في الفئران الضابطة.
4. راقب بعد الحقن للتأكد من نجاح الشفاء من التخدير وأن يمكنها دعم نفسها على وسادة القدم الخلفية المحقونة.

فئة < ص = "jove_title" >5. حقن CFSE

1. تحضير CFSE للحقن
   1. قم بإذابة قارورة من محلول مخزون CFSE 5 ملي من -80 درجة مئوية. أعد تعليق المحلول جيدا قبل ملء المحقنة استعدادا للحقن.
2. حقن CFSE والانتعاش
   1. كرر إجراء تخدير في القسم 3. حقن 20 ميكرولتر من 0.5 ملي CFSE في وسادة القدم الخلفية التي تلقت سابقا BCG أو PBS.
      ملاحظه: يجب إجراء حقن CFSE في اليوم السابق (24 ساعة) للتاريخ المخطط للتضحية.

< p class = "jove_title" >6. الاستئصال الجراحي للعقدة الليمفاوية المأبضية (pLN)

ملاحظة: يتم تشجيع استخدام الأدوات الجراحية المعقمة وتطهيرها المتكرر في 70٪ من الإيثانول خلال هذه الخطوة.

1. القتل الرحيم للفئران. رش بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بتثبيت في الوضع الظهري ، على لوحة تشريح.
   ملاحظه: يمكن للمؤلفين أن يوصوا بالقتل الرحيم من خلال خلع عنق الرحم.
2. قم بعمل شق رأسي بعناية في الفخذ الخلفي. قم بتنظيف العضلات والدهون باستخدام المقص والملاقط لكشف وبالتالي استئصال pLN الموجود في عمق الحقيبة الدهنية ، في تجويف الركبة.
3. انقل pLN إلى 0.5 مل PBS معقم ، على الثلج.

< p class = "jove_title" >7. توليد نظام تعليق أحادي الخلية من pLN

1. قم بتجانس pLN من خلال مصفاة خلوية سعة 70 ميكرون موضوعة في صفيحة مكونة من 6 آبار تحتوي على 5 مل PBS أو مخزن مؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) (PBS يحتوي على 2٪ مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) ، و 5 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، و 1 ملي مولار أزيد الصوديوم). تجانس من خلال المصفاة باستخدام الطرف الخلفي لحقنة 3 مل.
   ملاحظه: أزيد الصوديوم سام ويجب التعامل معه بحذر.
2. اغسل المصفاة ب 5 مل أخرى من PBS أو FACS ، واجمع المادة في أنبوب سعة 15 مل ، وحبيب الخلايا عند 277 × جم (1,200 دورة في الدقيقة ، R = 172 مم) لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية. بدلا من ذلك ، قم بتجانس pLNs مباشرة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة باستخدام مجانسات البولي بروبلين.
3. بناء على حجم الحبيبات ، أعد تعليق تعليق pLN في حجم مناسب من PBS أو المخزن المؤقت FACS ، على سبيل المثال ، 200 - 1,000 ميكرولتر. استخدم غرفة عد لتحديد العدد الإجمالي للخلية التي تم الحصول عليها من كل تعليق LN. استخدم تريبان بلو لاستبعاد الخلايا الميتة / المحتضرة.

< p class = "jove_title" >8. تلطيخ الخلايا وقياس التدفق الخلوي

1. انقل 1 - 10 × 10⁶ خلايا إلى 5 مل من أنابيب البوليسترين المستديرة القاع. يغسل باستخدام عازلة FACS ، والحبيبات بالطرد المركزي عند 277 × جم (1,200 دورة في الدقيقة ، R = 172 مم) لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية.
2. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 50-100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة (انظر علامات الخلية المتغصنة [DC] المستخدمة في تلطيخ السطح ، جدول المواد) التي تحتوي على 0.5 - 1 ميكروغرام من CD16 / CD32 المضاد للفأر (لمنع التفاعلات غير المحددة بوساطة FC) في المخزن المؤقت FACS لمدة 30 - 45 دقيقة ، على الجليد. حماية العينات من الضوء.
3. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا بمحلول FACS والحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 277 × جم (1,200 دورة في الدقيقة ، R = 172 مم) لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية.
4. قم بتعليق الخلايا في 50 - 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. الحصول على البيانات على مقياس التدفق الخلوي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات إيزوفلوران باكستر 1001936060 5- و 6-كربوكسي فلوريسين ثنائي أسيتات السكسينيمديل إستر (CFSE) إنفيتروجين ج 1157 ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) سيغما د2650 مصل الأبقار الجنينية (FBS) سيغما F7524 باسيل كالميت-غيران (BCG) سلالة باستور ، في المنزل محلول تريبان الأزرق سيغما تي 8154 EDTA في المنزل أزيد الصوديوم سيغما S2002 برنامج تلفزيوني في المنزل المياه المفلترة في المنزل BD بلاستيباك حقنة 3 مل BD للأنظمة الجراحية الطبية 309658 البديل: حقنة 5 مل 6 أطباق بئر برنامج النقاط التجارية 92006 أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل برنامج النقاط التجارية 91015 روبلين 5 مل أنابيب مستديرة القاع بي دي فالكون 3272948 البوليستيرين وحدة التخدير Univentor 400 يونيفنتور 8323001 حقنة مونوجيت 3/10 مل ميدي كاريير 8881511144 29 جم × 1/2 بوصة. وحدة الفلتر المعقمة برنامج النقاط التجارية 99500 غشاء PES EPPI-Pistill-الخالط شويت للتكنولوجيا الحيوية 3.200 512 روبلين جهاز الطرد المركزي Allegra X-30R بيكمان كولتر ب01145 غرفة عد بوركر VWR 631-0920 0.5 مل غطاء المسمار microtube سارستيدت 72.73 دولار روبلين 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق Eppendorf VWR 700-5239 روبلين مصافي خلايا 70 ميكرون VWR 734-0003 برنامج تحليل الخلايا FlowJo نجمة الشجرة جسم استنساخ شركة الاجسام المضاده MHC-II I-A/I-E م 5 / 114.15.2 BD Biosciences CD11b م 1 / 70 BD Biosciences CD11c إتش إل 3 BD Biosciences CD16 / CD32 (كتلة FC) 2.4 جي 2 BD Biosciences CD326 / EpCAM G8.8 بيوليجند سي دي 103 2.00 إ +07 بيوليجند سي دي 80 16-10 أ 1 بيوليجند سي دي 86 GL-1 بيوليجند