تقييم في الوقت الفعلي للنشاط المضاد للفطريات للخلايا المناعية البشرية الأولية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Brunel ، S. F. et al. ، تصوير حي للنشاط المضاد للفطريات بواسطة العدلات الأولية البشرية والخلايا الوحيدة استجابة ل A. fumigatus.J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تصوير الخلايا الحية لتحليل النشاط المضاد للفطريات في العدلات البشرية باستخدام Aspergillus reporter conidia. في البداية ، يتم الكشف عن كل من التألق الأحمر والأرجواني داخل العدلات ، بينما يتناقص التألق الأحمر بمرور الوقت ، مما يشير إلى تدهور الكونيديا ويؤكد النشاط المضاد للفطريات للعدلات.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. A. fumigatus الثقافة والظروف

1. تحضير الحد الأدنى من وسط أجار الجلوكوز كما هو موضح.
   1. اضبط الوسائط على درجة الحموضة 6.5 باستخدام 1 متر من هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) والأوتوكلاف عند 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
   2. اتركيه ليبرد حتى 65 درجة مئوية.
   3. العمل في غطاء تدفق معقم ، صب 30 مل من الوسائط المبردة في قارورة T75 واتركها لتبرد مع وضع عنق القارورة على ماصة سعة 25 مل لإنشاء منحدر أجار.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الجلسرين سيغما جي 6279 http://www.sigmaaldrich.com قارورة T75 غرينر بيو ون 658 175 http://www.greinerbioone.com/ برنامج تلفزيوني جيبكو 20012-019 https://www.thermofisher.com/ توين 80 فيشر ساينتيك 10592955 https://nl.fishersci.com/ مرشح 40 ميكرومتر ثيرمو فيشر العلمي 22363547 https://www.thermofisher.com/ 15 مل أنبوب فالكون غرينر بيو ون 188 261 http://www.greinerbioone.com/ 50 مل أنبوب فالكون غرينر بيو ون 227 261 http://www.greinerbioone.com/ ملي كيو ميليبور QGARD00R1 تعمل المياه النانوية النقية بالمثل. http://www.merckmillipore.com/ البيوتين المجسات الجزيئية ب -6352 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html DMSO سيغما د5879 http://www.sigmaaldrich.com ستربتافيدين - AF633 المجسات الجزيئية إس 21375 AF633 هو الفلوروفور الوحيد الذي تم اختباره حتى الآن والذي لا يزال مرئيا في البلعمة. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html أنابيب الدم EDTA غرينر بيو ون 455036 يجب أن تعمل أي أنابيب دموية تحتوي على عامل مضاد للتخثر. http://www.greinerbioone.com/en/start/ فيكول باك بلس جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17-1440-03 http://www3.gehealthcare.com/ تريبان بلو ثيرمو فيشر العلمي SV3008401 https://www.thermofisher.com/ HBSS جيبكو 14170112 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html ميكروبيدات CD14 ميلتيني بيوتك 130-050-201 يمكن أيضا استخدام طرق عزل الخلايا الأحادية الأخرى ، فنحن نفضل هذه الطريقة لأنها تعطي نقاء عاليا ثابتا للخلايا الوحيدة دون أن تكون كثيفة العمالة. http://www.miltenyibiotec.com/en/ أعمدة MS ميلتيني بيوتك 130-042-201 انظر التعليق على ميكروبيدات CD14. http://www.miltenyibiotec.com/en/ RPMI + جلوتاماكس جيبكو 72400-021 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html CO2 وسط مستقل ثيرمو فيشر العلمي 18045054 ضروري إذا لم يكن هناك تبادل كاف لثاني أكسيد الكربون أثناء التصوير. https://www.thermofisher.com/uk/en/home μ شريحة 8 قاع زجاجي المرجع نفسه 80827 هذا هو طبق التصوير الذي نستخدمه ، ولكن يجب أن يعمل أي طبق تصوير زجاجي بالحجم المناسب. http://ibidi.com/ نظام تصوير الخلايا الحية UltraVIEW VoX 3D بيركين إلمر L7267000 يتضمن برنامج volocity للاقتناء والتحليل. http://www.perkinelmer.com/