تقييم في الوقت الفعلي للنشاط المضاد للفطريات للخلايا المناعية البشرية الأولية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Brunel ، S. F. et al. ، تصوير حي للنشاط المضاد للفطريات بواسطة العدلات الأولية البشرية والخلايا الوحيدة استجابة ل A. fumigatus.J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تصوير الخلايا الحية لتحليل النشاط المضاد للفطريات في العدلات البشرية باستخدام Aspergillus reporter conidia. في البداية ، يتم الكشف عن كل من التألق الأحمر والأرجواني داخل العدلات ، بينما يتناقص التألق الأحمر بمرور الوقت ، مما يشير إلى تدهور الكونيديا ويؤكد النشاط المضاد للفطريات للعدلات.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. A. fumigatus الثقافة والظروف

1. تحضير الحد الأدنى من وسط أجار الجلوكوز كما هو موضح.
   1. اضبط الوسائط على درجة الحموضة 6.5 باستخدام 1 متر من هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) والأوتوكلاف عند 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
   2. اتركيه ليبرد حتى 65 درجة مئوية.
   3. العمل في غطاء تدفق معقم ، صب 30 مل من الوسائط المبردة في قارورة T75 واتركها لتبرد مع وضع عنق القارورة على ماصة سعة 25 مل لإنشاء منحدر أجار.
قم
2. بإخراج سلالة dsRed Af293-Aspergillus fumigatus على الأجار واحتضانها لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂). ستنتج قارورتان ما يقرب من 10⁹ كونيديا في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بنسبة 5 مل قبل البيوتينيل.

< p class = "jove_title" >2. A. fumigatus وضع العلامات والتحضير

ملاحظة: عند إجراء هذا الاختبار لأول مرة ، قم بإعداد سلالة Af293-A. fumigatus. خذ عينات من كلتا السلالتين في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وقم بتسمية واحدة فقط من كل سلالة كما هو موضح أدناه. سيسمح ذلك للمرء بالحصول على كونيديا تحكم بدون لون وكونيديا بلون واحد ، إما dsRed أو Alexa Fluor 633 (AF633) ، لاختبار الإعداد والمعدات.

1. حصاد A. fumigatus conidia عن طريق غمر المزرعة ب 30 مل PBS + 0.05٪ Tween-80. قم بتصفية التعليق الناتج من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل لإزالة شظايا الخيط.
2. جهاز طرد مركزي عند 805 × جم لمدة 10 دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية ، واغسلها مرة واحدة في 20 مل من PBS المعقم. تجمع كونيديا من طبقين من نفس السلالة أثناء خطوة الغسيل.
3. بعد خطوة الغسيل ، قم بتعليق الحبيبات في 5 مل من PBS ونقل 1 مل من التعليق المخروطي إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. عادة ما يكون 1 مل من تعليق كل سلالة كافيا لتصوير الخلايا الحية. لف الحصص المتبقية في ورق القصدير واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
أجهزة
4. الطرد المركزي من التعليق المخروطي عند 9,300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة المادة الطافية بعناية. أعد تعليق الحبيبات الكونيدية في 1 مل 0.05 م بيكربونات الصوديوم (NaHCO₃) درجة الحموضة 8.3.
5. تحضير محلول مخزون 10 مجم من البيوتين / 200 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) عن طريق إعادة تكوين 25 مجم من البيوتين في 500 ميكرولتر من DMSO. أضف 10 ميكرولتر من محلول مخزون البيوتين / DMSO إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، وقم بتغطيته بورق الألمنيوم ، واحتضانه لمدة ساعتين على كرسي هزاز عند 4 درجات مئوية.
   1. اقتبس ما تبقى من محلول مخزون البيوتين / DMSO وقم بتجميدها عند -20 درجة مئوية لاستخدامها في التجارب اللاحقة.
6. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 9,300 × جم وقم بإزالة المادة الطافية بعناية. أعد تعليق الحبيبات الكونيدية في 1 مل من 100 ملي تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان هيدروكلوريد (Tris-HCl) الرقم الهيدروجيني 8.0 لمدة ساعة واحدة لإلغاء تنشيط البيوتين العائم الحر.
7. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 9,300 × جم وقم بإزالة المادة الطافية بعناية. اغسل الحبيبات مرتين باستخدام 1 مل من PBS المعقم وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من PBS.
8. قم بإذابة 1 مجم من Streptavidin-AF633 في 0.5 مل من PBS لعمل محلول مخزون 2 مجم / مل. أضف 10 ميكرولتر من 2 مجم / مل من الستربتافيدين-AF633 لكل 1 مل من التعليق المخروطي واحتضنه لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على هزاز مغطى بورق الألمنيوم. يمكن تجميد الستربتافيدين-AF633 المتبقي في حصص لاستخدامه في التجارب اللاحقة.
9. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 9,300 × جم وقم بإزالة المادة الطافية بعناية. أعد تعليق الحبيبات الكونيدية في 1 مل من PBS وعد الكونيديا باستخدام مقياس كثافة الدم عند تخفيف 1: 1,000 (1: 100 ثم 1:10). اضبط التركيز المخروطي على 3.6 × 10⁶ / مل باستخدام وسائط مستقلة عن ثاني أكسيد الكربون₂ ، ولفها بورق الألمنيوم واحفظها عند 4 درجات مئوية
   ملاحظه: تم تصنيف الكونيديا الآن ب AF633 وسيشار إليها باسم FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia.
10. اختياري: إذا كان التحفيز باستخدام الكونيديا المتورمة مطلوبا ، بعد عد الكونيديا (الخطوة 2.9) ، قم بتخفيف الكونيديا إلى 7.2 × 10⁶ / مل في وسط قاعدة نيتروجين الخميرة (YNB) وأضف 500 ميكرولتر من المعلق المخروطي إلى 4.5 مل وسط YNB في قارورة إرلينماير معقمة سعة 50 مل. قم بتغطية القارورة ووضعها في حاضنة اهتزاز (200 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية) لمدة 6 ساعات.
    1. انقل الوسط إلى أنبوب سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 805 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة واغسله مرة واحدة في PBS. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى وإعادة تعليق الحبيبات في 1 مل ثاني أكسيد الكربون₂ وسط مستقل ، مما يعطي 3.6 × 10⁶ كونيديا / مل
       ملاحظة: تتكتل الكونيديا بشكل متكرر بعد أن تصبح منتفخة مما يجعل العد الدقيق أمرا صعبا ، ينصح بالحساب بالأرقام المحسوبة للكونيديا المريحة المستخدمة.

< p class = "jove_title" >3. عزل العدلات البشرية والخلايا الوحيدة

1. اسحب 20 مل من الدم الوريدي من متطوعين أصحاء إلى أنبوبين دميين سعة 10 مل يحتويان على حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA). لكل متبرع على حدة ، صب 20 مل من الدم في أنبوب سعة 50 مل وقم بتخفيفه ب 15 مل PBS.
2. قم بتغطية الدم ب 15 مل من محلول عزل الخلايا الليمفاوية (الكثافة 1.077 جم / مل) باستخدام حقنة وإبرة حديدية. ضع الإبرة في الجزء السفلي من الأنبوب وادفع محلول عزل الخلايا الليمفاوية برفق إلى الخروج. جهاز طرد مركزي عند 630 × جم لمدة 20 دقيقة بدون فرامل وتسارع منخفض.
3. تحضير PBS ، مبردة على الثلج.
   ملاحظه: يجب اتباع الخطوتين 3.4 و 3.5 في وقت واحد لتوليد الخلايا الوحيدة (3.4) والعدلات (3.5).
4. باستخدام معجنة ، قم بحصاد طبقة خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMC). هذه هي الطبقة الموجودة في الوسط بين المصل الأصفر (العلوي) ومحلول عزل الخلايا الليمفاوية الشفاف (السفلي) ، وتنقل إلى أنبوب جديد سعة 50 مل.
   1. املأ الأنبوب ب PBMC حتى 50 مل ب PBS البارد وجهاز الطرد المركزي عند 582 × جم لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية واغسلها مرتين باستخدام PBS البارد وأعد تعليقها في 1 مل من PBS لكل 20 مل من دم المتبرع المستخدم في البداية.
   2. قم بعمل 1:10 تخفيفات للعد عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 160 ميكرولتر من PBS و 20 ميكرولتر من أزرق التريبان. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
   3. قم بإعداد محلول عازل عن طريق إضافة 26 مل من مصل ربلة الساق الجنينية المعطلة بالحرارة (FCS) و 2.1 مل من 0.5 M EDTA إلى 500 مل من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS). الطرد المركزي للخلايا لمدة 10 دقائق عند 515 × جم وإعادة تعليقها في 40 ميكرولتر من المحلول العازل لكل 1 × 10⁷ خلايا.
   4. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل وأضف 10 ميكرولتر من حبيبات CD14 لكل 1 × 10⁷ خلايا ، واخلطها جيدا ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، مع التأكد من خلط الأنابيب كل 5 دقائق.
   5. اغسل الخلايا بإضافة 1 مل من المحلول العازل لكل 1 × 10⁷ خلايا وجهاز طرد مركزي عند 515 × جم لمدة 10 دقائق.
   6. استنشاق المادة الطافية تماما وإعادة تعليق ما يصل إلى 1 × 10⁸ خلايا في 500 ميكرولتر من المحلول العازلة.
   7. ضع عمودا واحدا لكل عينة على فاصل مغناطيسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أولا ، اغسل العمود مرة واحدة ب 500 ميكرولتر من محلول العازلة.
   8. ماصة 500 ميكرولتر من تعليق الخلية عبر العمود ، وانتظر حتى يجف العمود ، ثم اغسلها بتكرار ذلك ثلاث مرات باستخدام محلول عازل.
   9. ضع أنبوبا جديدا سعة 15 مل أسفل العمود وانزع العمود عن الفاصل المغناطيسي. ثم اغسل الخلايا من العمود إلى الأنبوب باستخدام 1 مل من المحلول العازل.
   10. أضف 4 مل من محلول المخزن المؤقت وأجهزة الطرد المركزي عند 515 × جم لمدة 10 دقائق ، ثم أعد تعليقها في 1 مل من وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI).
   11. قم بعمل 1:10 تخفيفات للعد عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 160 ميكرولتر من PBS و 20 ميكرولتر من أزرق التريبان. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
   12. اضبط تركيز الخلية على 6 × 10⁵ / مل مع RPMI وبذرة 200 ميكرولتر على طبق تصوير زجاجي مقاس 35 مم. احتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   13. في اليوم التالي ، قبل التصوير ، قم بإزالة RPMI وأضف 200 ميكرولتر من الوسط المستقل عن ثاني أكسيد الكربون.
       ملاحظه: يمكن أيضا تمييز هذه الخلايا الوحيدة إلى مجموعات فرعية مختلفة من البلاعم قبل التصوير. إذا كانت هذه تقنية يجب استكشافها ، فإن نقطة البداية الممتازة هي ورقة بحثية حديثة كتبها Ohradanova-Repic et al.
5. بعد حصاد طبقة PBMC ، قم بإزالة كل المصل ومعظم محلول عزل الخلايا الليمفاوية ، ولكن احرص على عدم إزالة الشريط الأبيض الصغير أعلى الحبيبات الحمراء لأن هذا سيحتوي على معظم العدلات.
   1. قم بإعداد مخزون عازل للتحلل المنخفض التوتر 10x عن طريق إضافة 83 جم من كلوريد الأمونيوم (NH₄Cl) و 10 جم من بيكربونات البوتاسيوم (KHCO₃) في 1 لتر من الماء المعقم. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   2. خفف هذا المرق 10x بالماء المعقم وأضفه إلى الأنابيب. ثم اقلبها بعناية 3 مرات واحتضانها في الثلج لمدة 15 دقيقة.
   3. جهاز طرد مركزي عند 394 × جم لمدة 10 دقائق ويعاد تعليقه في مخزن مؤقت للتحلل المنخفض التوتر لمدة 10 دقائق في الثلج.
   4. جهاز طرد مركزي عند 394 × جم واغسله مرتين باستخدام PBS البارد. يعلق في 1 مل من الوسط المستقل عن ثاني أكسيد الكربون₂ لكل متبرع.
   5. قم بعمل 1:10 تخفيفات للعد عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 160 ميكرولتر من PBS و 20 ميكرولتر من أزرق التريبان. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
   6. للفحص المجهري ، أضف 200 ميكرولتر من نفس تعليق الخلية إلى طبق تصوير زجاجي مقاس 35 مم. < / > ملاحظة: يجب البدء في التصوير بالعدلات أو قياس التدفق الخلوي على الفور بسبب ميلهم إلى الخضوع لموت الخلايا المبرمج إذا تركوا دون تحفيز. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فيجب الاحتفاظ بالعدلات على الجليد واستخدامها في أسرع وقت ممكن (في نفس اليوم).

< p class = "jove_title" >4. الفحص المجهري لفيديو الخلية الحية

ملاحظة: سيعتمد اختيار المجهر على ما هو متاح محليا ، ولكن سيحتاج إعداد المجهر إلى تضمين مرحلة مقلوبة ، وغرفة بيئية يتم تسخينها إلى 37 درجة مئوية ومرشحات الإثارة / الانبعاث المناسبة ل dsRed (532/561 نانومتر) و AF633 (633 نانومتر). لا تعمل FLARE conidia مع ليزر 488 نانومتر بدلا من ليزر 532/561 نانومتر ل dsRed. عند إجراء هذه التجربة لأول مرة ، استخدم كونيديا التحكم بدون لون ولون واحد لاختبار تألق الخلفية والنزيف بين قنوات dsRed و AF633.

1. قم بتشغيل سخان المجهر قبل التجربة واترك وقتا كافيا لتسخين غرفة التحكم البيئي إلى 37 درجة مئوية. سيختلف الوقت المستغرق لاستقرار درجة حرارة الغرفة باختلاف إعدادات المجهر.
2. قم بتشغيل المجهر والكمبيوتر ، وقم بتحميل برنامج التصوير. قم بتركيب طبق التصوير على مرحلة المجهر واضبط التركيز للعثور على العدلات البشرية أو الخلايا الوحيدة.
3. بالنسبة إلى dsRed و AF633 ، اضبط طاقة الليزر على 10٪ ووقت التعرض إلى 1 ثانية في إعدادات الاستحواذ.
4. قم بإزالة شريحة التصوير وأضف 100 ميكرولتر من 3 × 10⁶ / مل معلق مخروطي FLARE إلى الآبار المناسبة (الحجم الإجمالي 300 ميكرولتر / بئر). سجل وقت إضافة FLARE conidia إلى الطبق.
5. أعد الشريحة إلى المسرح واضبط حساسية الكاميرا ل dsRed و AF633 لرؤية الكونيديا بوضوح ولكن لا تعريض الصورة بشكل مفرط. قم بإعداد قائمة نقاط المرحلة إذا كان اكتساب النقاط المتعددة مطلوبا.
6. ابدأ التصوير عندما تكون جميع النقاط في التركيز البؤري ، ويتم تحسين القنوات وتعيين وقت الدورة ومدتها. يعتمد وقت الدورة ومدة التصوير على السؤال التجريبي. الهدف هو الحفاظ على وقت الدورة قصيرا قدر الإمكان (≤2 دقيقة) مع 1 دقيقة تسمح بتحليل متعمق لديناميكيات الامتصاص.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الجلسرين سيغما جي 6279 http://www.sigmaaldrich.com قارورة T75 غرينر بيو ون 658 175 http://www.greinerbioone.com/ برنامج تلفزيوني جيبكو 20012-019 https://www.thermofisher.com/ توين 80 فيشر ساينتيك 10592955 https://nl.fishersci.com/ مرشح 40 ميكرومتر ثيرمو فيشر العلمي 22363547 https://www.thermofisher.com/ 15 مل أنبوب فالكون غرينر بيو ون 188 261 http://www.greinerbioone.com/ 50 مل أنبوب فالكون غرينر بيو ون 227 261 http://www.greinerbioone.com/ ملي كيو ميليبور QGARD00R1 تعمل المياه النانوية النقية بالمثل. http://www.merckmillipore.com/ البيوتين المجسات الجزيئية ب -6352 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html DMSO سيغما د5879 http://www.sigmaaldrich.com ستربتافيدين - AF633 المجسات الجزيئية إس 21375 AF633 هو الفلوروفور الوحيد الذي تم اختباره حتى الآن والذي لا يزال مرئيا في البلعمة. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html أنابيب الدم EDTA غرينر بيو ون 455036 يجب أن تعمل أي أنابيب دموية تحتوي على عامل مضاد للتخثر. http://www.greinerbioone.com/en/start/ فيكول باك بلس جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17-1440-03 http://www3.gehealthcare.com/ تريبان بلو ثيرمو فيشر العلمي SV3008401 https://www.thermofisher.com/ HBSS جيبكو 14170112 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html ميكروبيدات CD14 ميلتيني بيوتك 130-050-201 يمكن أيضا استخدام طرق عزل الخلايا الأحادية الأخرى ، فنحن نفضل هذه الطريقة لأنها تعطي نقاء عاليا ثابتا للخلايا الوحيدة دون أن تكون كثيفة العمالة. http://www.miltenyibiotec.com/en/ أعمدة MS ميلتيني بيوتك 130-042-201 انظر التعليق على ميكروبيدات CD14. http://www.miltenyibiotec.com/en/ RPMI + جلوتاماكس جيبكو 72400-021 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html CO2 وسط مستقل ثيرمو فيشر العلمي 18045054 ضروري إذا لم يكن هناك تبادل كاف لثاني أكسيد الكربون أثناء التصوير. https://www.thermofisher.com/uk/en/home μ شريحة 8 قاع زجاجي المرجع نفسه 80827 هذا هو طبق التصوير الذي نستخدمه ، ولكن يجب أن يعمل أي طبق تصوير زجاجي بالحجم المناسب. http://ibidi.com/ نظام تصوير الخلايا الحية UltraVIEW VoX 3D بيركين إلمر L7267000 يتضمن برنامج volocity للاقتناء والتحليل. http://www.perkinelmer.com/