مقالة منهجية

استخدام الطبقات الدهنية الثنائية المدعومة بالخرز للتحقيق في الإخراج المشبكي من الخلايا التائية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Céspedes، P. F.، et al. تحضير طبقات الدهون الثنائية المدعومة بالخرز لدراسة ناتج الجسيمات من المشابك المناعية للخلايا التائية. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو إعادة تكوين الخلايا العارضة للمستضد الاصطناعي من خلال الطبقات الدهنية الثنائية المدعومة بالخرز وتطبيقها في تقييم الناتج المشبكي الناتج عن الخلايا التائية المنشطة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. معايرة كثافة البروتين على BSLBs (طبقات ثنائية الدهون المدعومة بالخرزة)

  1. قبل أخذ حبات السيليكا غير الوظيفية بقطر 5.00 ±0.05 ميكرومتر ، امزج محلول المرق جيدا وأعد تعليق أي كتل كبيرة من الخرز المترسبة في قاع القوارير.
    ملاحظة: تميل حبات السيليكا إلى الترسيب بسرعة ، مما قد يؤدي إلى أخطاء في العد. امزج بقوة عن طريق سحب ماصة نصف الحجم الأقصى للماصة الدقيقة P1000 لأعلى ولأسفل.
  2. قم بتخفيف 1 ميكرولتر من محلول الخرزة في 1,000 ميكرولتر من PBS ، وعد الخرزات باستخدام غرفة مقياس الدم ، واحسب تركيزها لكل مل
    ملاحظه: ليست هناك حاجة إلى تلطيخ التريبان الأزرق لتصور حبات السيليكا.
  3. احسب حجم حبات السيليكا اللازمة ل 5 × 105 BSLBs النهائية لكل نقطة من المعايرة.
  4. انقل الحجم المطلوب من حبات السيليكا إلى أنبوب معقم للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل.
  5. اغسل حبات السيليكا ثلاث مرات باستخدام 1 مل من PBS المعقم ، وقم بالطرد المركزي للحبات لمدة 15 ثانية على جهاز طرد مركزي دقيق على طاولة عند RT (عند دورة ثابتة في الدقيقة).
    ملاحظة: عند إزالة محلول الغسيل ، تجنب إزعاج حبيبات الخرزة. لن يؤثر العمود العازل الصغير على انتشار الجسيمات الشحمية التي يتكون منها مزيج الجسيمات الشحمية الرئيسية لأنها موجودة أيضا في PBS.
  6. قم بإعداد ثلاثة مجلدات من مزيج الجسيمات الشحمية الرئيسية لتجميع BSLB على حبات السيليكا المغسولة (على سبيل المثال ، إذا كان الحجم الإجمالي الأولي لحبات السيليكا هو 20 ميكرولتر ، فقم بإعداد ما لا يقل عن 60 ميكرولتر من مزيج الجسيمات الشحمية الرئيسية).
  7. لمعايرة PE mol٪ بغطاء البيوتوتينيل
    1. تحضير خلطات الدهون الرئيسية التي تحتوي على تخفيفات 5 أضعاف من غطاء البيوتينيل PE.
      1. قم بتخفيف غطاء البيوتينيل PE 0.4 ملي مولار في مصفوفة DOPC بنسبة 100٪.
      2. امزج كل نقطة معايرة من Pe Mol٪ بغطاء البيوتينيل بنسبة 1: 1 (المجلد: الحجم) مع محلول 0.4 ملي مولار 25٪ DGS-NTA (Ni) بحيث يكون هناك 12.5 مول٪ نهائي من الدهون المحتوية على النيكل في جميع عمليات المعايرة.
        ملاحظه: تمثل نسبة 12.5 مول٪ (الحجم: المحجم) من الدهون المحتوية على النيكل التركيبة الدهنية المختلطة ل BSLBs والتي يمكن أيضا اختبار البروتينات الموسومة عليها في معايرة متوازية. على سبيل المثال ، نظرا لأن جميع مخزونات الجسيمات الشحمية يتم تحضيرها بنفس التركيز المولي ، للوصول إلى خليط mol٪ المستهدف في 200 ميكرولتر من مزيج الجسيمات الشحمية النهائي ، ما عليك سوى خلط 100 ميكرولتر من 25 مول٪ من DGS-NTA المحتوي على النيكل مع 100 ميكرولتر من 100 مول٪ DOPC.
    2. انقل 5 × 105 حبات السيليكا المغسولة إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل ، بحيث يتم تجميع نقطة معايرة واحدة من Biotinyl Cap PE mol٪ لكل أنبوب.
    3. أضف خلطات المعايرة بالتحليل الحجمي PE mol٪ بغطاء البيوتينيل إلى حبيبات السيليكا المغسولة واخلطها برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل نصف الحجم الإجمالي. تجنب تكوين الفقاعات التي تدمر الطبقة الدهنية الثنائية بشكل زائد.
    4. أضف غاز الأرجون (أو النيتروجين) على الأنبوب الذي يحتوي على BSLBs التي تتشكل الآن لإزاحة الهواء وحماية الدهون من الأكسدة أثناء الخلط.
    5. أضف الأرجون إلى مخزون الدهون 0.4 ملي مولار قبل التخزين ومعالجته باستخدام تقنية معقمة.
      ملاحظه: قم بتوصيل أنبوب صغير بأسطوانة غاز الأرجون / النيتروجين. قبل إضافة الغاز إلى الأنابيب ، اضبط منظم أسطوانة الغاز بحيث لا يزيد الضغط عن 2 رطل لكل بوصة مربعة. قم بتوصيل طرف ماصة معقم بأنبوب المخرج لتوجيه تيار الغاز داخل مخزون الجسيمات الشحمية لمدة 5 ثوان وأغلق الغطاء بسرعة. في حالة مخزون الدهون ، أغلق غطاء الأنبوب بغشاء البارافين قبل تخزينه عند 4 درجات مئوية.
    6. انقل BSLBs إلى خلاط مختبر رأسي متغير الزاوية (انظر جدول المواد) واخلطه لمدة 30 دقيقة عند RT باستخدام خلط مداري يبلغ 10 دورة في الدقيقة.
      ملاحظه: ستمنع هذه الخطوة ترسيب الخرز أثناء تكوين طبقة الدهون الثنائية المدعومة.
    7. قم بتدوير الخرزات عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في RT على جهاز طرد مركزي صغير على سطح الطاولة ، ثم اغسله ثلاث مرات باستخدام 1 مل من HBS / HSA (BSA) لإزالة الجسيمات الشحمية الزائدة.
    8. قم بمنع BSLBs المشكلة عن طريق إضافة 1 مل من 5٪ كازين أو 5٪ BSA يحتوي على 100 ميكرومتر من NiSO4 لتشبع مواقع NTA و 200 نانومتر ستربتافيدين لتغطية جميع مواقع تثبيت البيوتين على BSLBs بشكل موحد. امزج برفق عن طريق سحب نصف الحجم الكلي لأعلى ولأسفل واحتضنه في الخلاط الرأسي لمدة لا تزيد عن 20 دقيقة عند RT و 10 لفات في الدقيقة.
    9. قم بتدوير BSLBs عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في RT على جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة ، ثم اغسله ثلاث مرات باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت HBS / HSA (BSA).
      ملاحظه: احتفظ بالخرز المغسول عموديا مع حجم صغير من المخزن المؤقت للغسيل الذي يغطي BSLBs. تجنب جفاف BSLBs لأن الهواء سيدمر الطبقة الدهنية الثنائية.
  8. لمعايرة البروتينات الموسومة به على 12.5 مول٪ من BSLBs المحتوية على DGS-(Ni) NTA
    1. تحضير ثلاثة أحجام من مزيج الجسيمات الشحمية الرئيسية التي تحتوي على 12.5 مول٪ نهائية من DGS-NTA (Ni).
    2. استخدم مزيج الجسيمات الشحمية الرئيسية لإعادة تعليق حبات السيليكا المغسولة واخلطها برفق عن طريق سحب نصف الحجم الكلي لأعلى ولأسفل. تجنب تكوين الفقاعات التي تلحق الضرر المفرط بالطبقة الدهنية.
    3. أضف غاز الأرجون (أو النيتروجين) على الأنبوب الذي يحتوي على BSLBs التي تتشكل الآن لإزاحة الهواء وحماية الدهون من الأكسدة أثناء الخلط.
    4. أضف الأرجون إلى مخزون الدهون 0.4 ملي مولار قبل التخزين وقم بمعالجته باستخدام تقنية معقمة.
    5. انقل BSLBs إلى الخلاط الرأسي واخلطها لمدة 30 دقيقة عند RT باستخدام الخلط المداري عند 10 دورات في الدقيقة.
    6. قم بتدوير الخرزات عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في RT على جهاز طرد مركزي صغير على سطح الطاولة ، ثم اغسله ثلاث مرات باستخدام 1 مل من HBS / HSA (BSA) لإزالة الجسيمات الشحمية الزائدة.
    7. قم بحظر BSLBs المشكلة عن طريق إضافة 1 مل من 5٪ كازين (أو 5٪ BSA) تحتوي على 100 ميكرومتر من NiSO4 لتشبع مواقع NTA على BSLBs. تخلط برفق وتحتضن في الخلاط الرأسي لمدة لا تزيد عن 20 دقيقة عند RT و 10 دورة في الدقيقة.
    8. اغسل ثلاث مرات باستخدام HBS / HSA (BSA) لإزالة محلول الحجب الزائد.
    9. في صفيحة جديدة من 96 بئر على شكل حرف U ، قم بإعداد تخفيفات تسلسلية من البروتينات بمقدار 2 أضعاف.
      1. قم بإعداد تركيز بدء قدره 100 نانومتر للبروتين محل الاهتمام بحجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت HBS / HSA (BSA) ، ووزع 100 ميكرولتر من هذا المحلول في العمود الأول ، و 100 ميكرولتر المتبقية أعلى العمود # 2 يحتوي على 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت HBS / HSA (BSA).
      2. استمر عن طريق نقل 100 ميكرولتر بشكل متسلسل من العمود #2 إلى العمود #3 وكرر ذلك حسب الضرورة لتغطية جميع نقاط المعايرة بالتحليل الحجمي. اترك العمود الأخير من السلسلة بدون بروتين ، حيث سيتم استخدامه كمرجع فارغ للقياس الكمي.
    10. يعلق الوحدات BSLB المعدة في حجم بحيث يتم احتواء 5 × 10 5 BSLBs في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت HBS/HSA (BSA).
    11. انقل 100 ميكرولتر من تعليق BSLB إلى آبار صفيحة ثانية ذات 96 بئرا على شكل حرف U ، بحيث يتلقى كل بئر 5 × 105 BSLBs.
    12. قم بتدوير اللوحة الثانية التي تحتوي على BSLBs لمدة دقيقتين عند 300 × جم و RT وتخلص من المادة الطافية.
    13. انقل الأحجام التي تبلغ 100 ميكرولتر من لوحة معايرة البروتين إلى اللوحة التي تحتوي على BSLBs المرسوبة. امزج برفق، وتجنب توليد الفقاعات الزائدة أثناء سحب العينات، واحتضنه لمدة 30 دقيقة عند RT و1,000 دورة في الدقيقة باستخدام شاكر اللوحة. احمي من الضوء بورق الألمنيوم.
    14. اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت HBS / HSA (BSA) باستخدام خطوات الترسيب 300 × جم لمدة دقيقتين عند RT.
    15. إذا كان البروتين المؤتلف المستخدم في المعايرة مترافقا مباشرة مع الفلوروكرومات وله قيم F / P معروفة.
    16. إذا كان البروتين المؤتلف المستخدم في المعايرة غير مسمى أو مترافقا مع الفلوروكرومات أو لم يكن هناك معيار حبة MESF متاح ، فاستخدم Alexa Fluor 488 أو 647-conjugated antibodies ذات قيم F / P المعروفة لتلطيخ BSLB المطلي بالبروتين.
    17. وصمة عار بتركيزات مشبعة من الأجسام المضادة للقياس الكمي.
      ملاحظة: اعتمادا على مستوى التعبير المستهدف ، تتراوح هذه بين 5 و 10 ميكروغرام / مل.
    18. وصمة عار لمدة 30 دقيقة عند RT و 1,000 دورة في الدقيقة باستخدام شاكر اللوحة. حماية من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
    19. يغسل مرتين باستخدام المخزن المؤقت HBS / HSA (BSA) ومرة واحدة باستخدام PBS باستخدام خطوات الترسيب 300 × جم لمدة دقيقتين عند RT.
      ملاحظه: استخدم PBS ، درجة الحموضة 7.4 لإعادة تعليق BSLBs المغسولة قبل الاستحواذ. لا تستخدم المخازن المؤقتة التي تحتوي على البروتين ، لأن هذا يؤدي إلى تكوين فقاعات أثناء الخلط التلقائي للعينات باستخدام أجهزة أخذ العينات عالية الإنتاجية.
    20. احصل على معايير MESF ، مع التأكد من بقاء القمم الأكثر سطوعا في نطاق الكشف الخطي لكاشف القياس الكمي (القناة) ، كما هو موضح في الشكل 1 ب (السابع).
    21. احصل على العينات يدويا أو باستخدام HTS. في حالة استخدام هذا الأخير ، قم بتعليق BSLBs في 100 ميكرولتر من PBS واحصل على 80 ميكرولتر باستخدام معدل تدفق يتراوح بين 2.5 و 3.0 ميكرولتر / ثانية ، وحجم خلط 100 ميكرولتر (أو 50٪ من الحجم الكلي إذا كان حجم إعادة التعليق أقل) ، وسرعة خلط تبلغ 150 ميكرولتر / ثانية ، وخمسة خلطات لضمان تشتت BSLBs.
    22. تصدير ملفات FCS.
    23. ركز على الأحداث الفردية للتحليلات (الشكل 2 أ) ، حيث ستؤدي التوائم المزدوجة أو التوائم الثلاثة إلى حدوث أخطاء في التحديد. استخدم التعريف المتداخل للأحداث الفردية كما هو موضح في خطوة البروتوكول 1.2.3.
    24. قم بقياس MFI لكل كسر MESF (1-4) واطرح MFI للحبات الفارغة لاستخراج MFIs المصححة (cMFI).
    25. إجراء تحليل انحدار خطي لاستخراج الميل (ب) من MESF على cMFI المحسوب لمعايير MESF.
    26. استخرج MFI لكل نقطة معايرة بالتحليل الحجمي واطرح MFI للخرز بدون بروتين للحصول على cMFIs.
    27. اقسم cMFIs على الميل المحسوب لاستخراج MESF المرتبط ب BSLBs لكل نقطة معايرة بالتحليل الحجمي.
    28. اقسم MESF المرتبط ب BSLBs على قيمة F / P للجسم المضاد للقياس الكمي لاستخراج متوسط عدد الجزيئات المرتبطة لكل BSLB.
    29. باستخدام قطر BSLBs (5.00 ± 0.05 ميكرومتر) ، استخرج مساحة سطح الخرزة (SA = 4pr2) لحساب الكثافة النهائية للبروتين (molec. / μm2) لكل نقطة معايرة (تركيز البروتين).
    30. قم بإجراء تحليل انحدار جديد لتركيز البروتين على كثافة البروتين لحساب المنحدر (ب) لخط الأنسب.
      ملاحظه: يمنح تركيز 12.5 مول٪ من DGS-NTA (Ni) قدرة تثبيت قصوى تبلغ حوالي 10,000 موليك / ميكرومتر 2 10 دون إحداث تنشيط غير محدد للخلايا التائية أو التأثير على الحركة الجانبية ل SLBs.

2. إجراء تجارب النقل المشبكي بين الخلايا التائية و BSLBs

  1. قبل تشغيل تجربة النقل المشبكي
    1. احصل على BSLBs غير الفلورية ، BSLBs مع دهون الفلورسنت ، الخلايا غير الملطخة (أو حبات التعويض ؛ انظر جدول المواد) ، والخلايا الملطخة أحادية اللون (أو حبات التعويض) لتحديد تفاعلات طيف التألق للأداة. ركز على تلك الكاشفات ذات الانتشار العالي لإعادة تصميم اللوحة متعددة الألوان وزيادة الحساسية وتقليل خطأ القياس على أجهزة الكشف الحرجة.
    2. معايرة الأجسام المضادة للكشف للعثور على التركيز الأمثل ، مما يتيح اكتشاف الأحداث الإيجابية دون المساس باكتشاف السلبيات.
      ملاحظه: كرر هذه الخطوة كلما كان هناك تغيير في الكثير من الجسم المضاد حيث تختلف قيم F / P والسطوع من دفعة إلى أخرى.
    3. اختياري: قم بتحسين الفولتية PMT عن طريق الحصول على العينة في نطاقات جهد مختلفة (أي يمشي الجهد) للعثور على PMTs التي تؤدي إلى إشارة مثالية على الضوضاء (أي فصل السلبيات والإيجابيات مع ضمان بقاء إشارة ألمع السكان في النطاق الخطي).
  2. قياس نقل إخراج الخلايا التائية إلى BSLBs
    1. تحضير مكمل RPMI 1640 (هنا R10 متوسط) يحتوي على 10٪ من مصل الأبقار الجنينية المعطل للحرارة (FBS) ، و 100 ميكرومتر من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 10 ملي مولار HEPES ، و 2 ملي مولار لجلوتامين ، و 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. استخدم وسيط R10 لزراعة الخلايا التائية وتوسيعها.
    2. في اليوم 1 ، عزل الخلايا التائية من غرف الدم المحيطي أو نظام تقليل البيضاء. استخدم مجموعات عزل خلايا الكثافة المناعية وفصلها (انظر جدول المواد) لإثراء الخلايا التائية البشرية CD4 + و CD8 +.
    3. قم بزرع الخلايا بتركيز نهائي يتراوح بين 1.5 و 2.0 × 106 خلايا / مل ، باستخدام ألواح 6 آبار لا يزيد إجمالي كل بئر عن 5 مل لكل بئر.
    4. قم بتنشيط الخلايا التائية باستخدام نسبة 1: 1 من الخرز المغناطيسي لتنشيط الخلايا التائية البشرية (مضاد ل CD3 / مضاد ل CD28) (انظر جدول المواد) وأضف 100 وحدة دولية من IL-2 البشري المؤتلف لدعم تكاثر الخلايا وبقائها على قيد الحياة.
    5. في اليوم 3 ، قم بإزالة الخرزات المغناطيسية المنشطة باستخدام أعمدة مغناطيسية (انظر جدول المواد). تأكد من بقاء الخرز المغناطيسي متصلة بجوانب الأنبوب قبل استعادة الخلايا لخطوات غسيل إضافية.
    6. اغسل الخرزات المغناطيسية مرة أخرى باستخدام 5 مل من وسط R10 الطازج ، واخلطها جيدا ، ثم ضعها مرة أخرى في المغناطيس. استرجع هذا الحجم واخلطه مع الخلايا المستردة في الخطوة 1.2.5.
    7. أعد تعليق الخلايا إلى 1.5-2 × 106 خلايا / مل في R10 الطازج الذي يحتوي على 100 وحدة / مل من IL-2. قم بتجديد الوسط بعد 48 ساعة ، مع التأكد من أن آخر إضافة ل IL-2 هي 48 ساعة قبل يوم التجربة (الأيام من 7 إلى 14 من الثقافة).
    8. في يوم تجربة النقل المشبكي ، قم بإعداد وسيط فحص النقل المشبكي عن طريق استكمال وسط RPMI 1640 الخالي من الفينول الأحمر مع 10٪ FBS ، و 100 ميكرومتر من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 2 ملي مولار L-glutamine ، و 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. لا تشمل IL-2 البشري المؤتلف.
    9. عد الخلايا باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق أو استبعاد التيار الكهربائي وأعد تعليقها إلى تركيز نهائي يبلغ 2.5 × 106 خلايا / مل في الوسط. إذا لوحظ موت الخلايا المفرط (>10٪) ، قم بإزالة الخلايا الميتة / المحتضرة باستخدام مزيج من عديد السكاريد ودياتريزوات الصوديوم (انظر جدول المواد) على النحو التالي:
      1. طبقة 15 مل من زراعة الخلايا فوق 13 مل من محلول السكريات السكرية والصوديوم.
      2. جهاز طرد مركزي ل 1,250 × جم لمدة 20 دقيقة عند RT مع الحد الأدنى من التسارع وعدم التسارع. اجمع طبقة الخلية (السحابة) في الواجهة بين الوسط ومحلول السكريات السكرية والصوديوم.
      3. اغسل الخلايا مرتين على الأقل باستخدام وسيط فحص النقل المشبكي المسخن مسبقا (تم إعداده في الخطوة 1.2.7).
      4. عد الخلايا وإعادة تعليقها إلى تركيز نهائي يبلغ 2.5 × 106 / مل باستخدام وسيط فحص النقل المشبكي. الزراعة المشتركة 100 ميكرولتر من معلق الخلية هذا مع BSLBs (انظر الخطوة 1.2.15).
    10. احسب عدد BSLBs اللازمة للتجربة ؛ ضع في اعتبارك جميع خلطات البروتين الرئيسية المختلفة ومعايرة المستضد التي سيتم اختبارها (إما مونومرات ببتيد HLA / MHC البيوتينيل أو أحادي البيوتينيل المضاد ل CD3ε Fab).
    11. قم بتجميع BSLBs باتباع نفس الخطوات من قسم البروتوكول 5 ولكن هذه المرة ، اجمع بين جميع معايرة البروتينات والدهون المطلوبة لإعادة تكوين غشاء APC معقد (الشكل 3 أ). احتفظ بنفس علاقات الحجم بين حجم حبات السيليكا الأولية وحجم مزيج البروتين المستخدم أثناء المعايرة ، بالإضافة إلى الأوقات ودرجات الحرارة المستخدمة في تحميل BSLBs. على سبيل المثال ، إذا تم استخدام 0.5 ميكرولتر من حبات السيليكا / البئر و 100 ميكرولتر / بئر من مزيج البروتين للمعايرة الأولية ، فحافظ على نسب 5: 1,000 vol: vol لإعداد BSLBs ليتم زراعتها مع الخلايا التائية.
    12. بمجرد تحميل BSLBs بمزيج البروتين ذي الأهمية ، اغسل BSLBs مرتين باستخدام HBS / HSA (BSA) لإزالة البروتينات الزائدة غير المرتبطة. استخدم سرعات ترسيب تبلغ 300 × جم لمدة دقيقتين عند RT في كل خطوة غسيل وتخلص من المواد الطافية
    13. قم بتعليق 5 × 105 BSLBs لكل بئر في 200 ميكرولتر.
    14. انقل 100 ميكرولتر لكل بئر إلى صفيحة جديدة ذات 96 بئرا على شكل حرف U لعمل نسخة مكررة ، بحيث تكون الكمية النهائية من BSLB لكل بئر 2.5 × 105.
    15. قم بتدوير BSLBs عند 300 × جم لمدة دقيقتين و RT وتخلص من المادة الطافية.
    16. أعد تعليق BSLBs باستخدام 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا التائية ؛ امزج برفق لمنع تكوين الفقاعات.
    17. احتضان المزارع المشتركة لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية
      ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن إعادة تعليق الخلايا والخرز في المخزن المؤقت HBS / HSA (BSA) بدلا من RPMI الخالي من الفينول الأحمر للزراعة المشتركة. في هذه الحالة ، يجب إجراء الحضانة في حاضنة غيرCO2 لأن هذا الغاز سيؤدي إلى تحمض المخزن المؤقت بسرعة في حالة عدم وجود البيكربونات.
    18. قم بتبريد المزارع المشتركة للخلايا BSLB-T عن طريق احتضان الخلايا أولا في RT لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.
    19. الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق عند 500 × جم و RT ؛ تخلص من المادة الطافية.
    20. أعد تعليق الخلايا في RT 2٪ BSA-PBS (Ca2+ و Mg2 + - مجانا) للحظر. ضع الخلايا على الجليد لمدة 45 دقيقة. حماية من الضوء.
    21. أثناء احتضان الخلايا ، قم بإعداد مزيج الأجسام المضادة الرئيسي باستخدام BSA بنسبة 2٪ مرشحة بنسبة 0.22 ميكرومتر في PBS كمخزن مؤقت للتلوين ، مما سيوفر حظرا إضافيا.
      ملاحظه: تميل بعض دفعات الأجسام المضادة المقترنة بأصباغ Brilliant Violet إلى الارتباط ب BSLBs بشكل غير محدد. يساعد الحظر باستخدام 5٪ BSA-PBS على تقليل هذه الضوضاء. من الآن فصاعدا ، تأكد من الحفاظ على سلسلة التبريد غير منقطعة.
    22. قم بتدوير المزارع المشتركة عند 500 × جم لمدة 5 دقائق و 4 درجات مئوية. قبل التخلص من المواد الطافية ، تأكد لفترة وجيزة من وجود الحبيبات عن طريق فحص الجزء السفلي من اللوحة المكونة من 96 بئرا باستخدام الإضاءة الخلفية.
    23. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أعد تعليق الخلايا في مزيج التلوين الرئيسي الذي يحتوي على تركيزات محسنة للأجسام المضادة.
      ملاحظه: استخدم أطراف الماصة بدون مرشح لمنع تكوين الفقاعات والأخطاء في توزيع أحجام التلوين.
    24. قم بتضمين الخلايا المسماة بالنمط المتماثل و BSLBs ، و BSLBs الفلورية وغير الفلورية ، والخلايا و BSLBs الملطخة بمفردها. احترم العدد الإجمالي للأحداث لكل بئر لجميع الضوابط (على سبيل المثال ، فقط BSLBs التي تحتوي على 5 × 105 BSLB / بئر ، وفقط عناصر التحكم الخلوية التي تحتوي على 5 × 105 خلايا / بئر لتجنب الزيادة النسبية في الأجسام المضادة لكل حدث ملطخ).
    25. تخلط برفق عن طريق سحب نصف الحجم لأعلى ولأسفل وتحتضن لمدة 30 دقيقة على الثلج. حماية من الضوء.
    26. اغسل الخلايا و BSLBs مرتين باستخدام 2٪ BSA-PBS ، ودرجة الحموضة 7.4 ، وخطوات الترسيب 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بتعليق المزارع المشتركة المغسولة في 100 ميكرولتر من PBS واحصل عليها على الفور.
    27. إذا كانت هناك حاجة إلى التثبيت ، فقم بإصلاحه باستخدام 0.5٪ وزن / حجم من PFA في PBS لمدة 10 دقائق ، واغسلها مرة واحدة ، واحتفظ بها في PBS حتى الاستحواذ. حماية من الضوء.
    28. قبل التعويض ، احصل على معايير MESF ، مما يضمن وقوع كل من السكان الأكثر تعتيما والأكثر سطوعا في النطاق الخطي للقياس.
    29. الحصول على عينات التعويض وحساب التعويض وتطبيق مصفوفة التعويض (الرابط) على التجربة.
    30. الحصول على ما لا يقل عن 2 × 10 4 من معايير MESF الإجمالية لكل قناة من قنوات القياس الكمي.
    31. للاقتناء باستخدام أجهزة أخذ العينات عالية الإنتاجية ، اضبط الحصول على الأداة على المعيار ، وضبط الحصول على العينة على 80 ميكرولتر (أو 80٪ من الحجم الإجمالي) ، ومعدل تدفق العينة بين 2.0 و 3.0 ميكرولتر / ثانية ، وحجم خلط العينة 50 ميكرولتر (أو 50٪ من الحجم الكلي لتجنب تكوين الفقاعات أثناء الخلط) ، وخلط العينة 150 ميكرولتر / ثانية ، والخلط لكل بئر بين 3 و 5.
    32. احصل على ما لا يقل عن 1 × 104 BSLBs مفردة لكل عينة (راجع لوحات الشكل 3 ب (i) - (vi) للحصول على استراتيجية البوابات المرجعية).
    33. اغسل مقياس الخلوي يعمل لمدة 5 دقائق بمحلول تنظيف متبوعا ب 5 دقائق من الماء عالي النقاء قبل إغلاق الجهاز. إذا كنت تستخدم HTS ، فاتبع الخيارات الموجودة أسفل علامة التبويب HTS وخيار تنظيف.
    34. تصدير ملفات FCS.
< p class = "jove_title" >3. قياس النقل المشبكي للجسيمات إلى BSLBs

  1. افتح ملفات FCS للتجربة. حدد مجموعة الخلايا و BSLBs بناء على مناطق تشتت الضوء الجانبية والأمامية (SSC-A مقابل FSC-A) ، كما هو موضح في الشكل 3 ب (ط).
  2. حدد الأحداث داخل نافذة الاستحواذ المستمر (الشكل 3 ب (2)).
  3. التركيز على الأحداث الفردية لكل من الخلايا و BSLB ؛ تحديد الخلايا المفردة أولا بناء على W المنخفض في البوابات المتسلسلة FSC-W / FSC-H (singlets-1 ، الشكل 3B لوحة (iii)) و SSC-W / SSC-H (singlets-2 ؛ الشكل 3 ب لوحة (رابعا)). حدد بوابة فردية-3 إضافية عن طريق تحديد الأحداث ذات FSC-A و FSC-H النسبية (الشكل 3B ، اللوحة (v)).
  4. استخرج MFI من كسور MESF فارغة و 1 إلى 4 ومن الخلايا المفردة و MESF لكل عينة تجربة.
  5. قم بإنشاء قيم MFI المصححة (cMFI) لكسور MESF من 1 إلى 4 عن طريق طرح MFI لمجموعة الخرزة الفارغة من كل كسر.
  6. قم بإنشاء cMFIs لوحدات BSLBs والخلايا المفردة (راجع لوحة الشكل 3C (i)).
  7. استخدم الإشارة من BSLB الملطخة بالأجسام المضادة للتحكم في النمط المتماثل لتصحيح MFI ل BSLB الملطخة بالأجسام المضادة ضد علامات الخلايا التائية ذات الصلة. استخدم cMFI لحساب النسبة المئوية للنقل المشبكي الطبيعي (NST٪) باستخدام المعادلة الموضحة في لوحة الشكل 3C (ii).
  8. إذا كنت مهتما بدلا من ذلك بالجسيمات المنقولة على وجه التحديد استجابة لتشغيل TCR ، فاطرح الإشارة من BSLBs الفارغة من MFI ل BSLBs الناهضة. استخدم cMFI هذا لحساب NST٪ المدفوع ب TCR باستخدام المعادلة الموضحة في لوحة الشكل 3C (ii).
  9. إذا كنت مهتما بتحديد العدد الإجمالي للجزيئات المنقولة كشحنة جسيمات عبر واجهة الخلية التائية BSLB ، فاحصل على حبات معيارية MESF باستخدام نفس إعدادات الأداة وجلسة الاستحواذ للزراعة المشتركة للخلية التائية BSLB.
  10. تحليل مجموعات حبات MESF واستخراج cMFIs الخاصة بهم. احسب ميل الخط الأنسب لتحليل انحدار MESF على cMFI.
  11. استخدم المنحدر المحسوب لاستخراج عدد MESF المودعة على BSLBs. استخدم cMFIs المحسوبة باستخدام عناصر تحكم النمط المتماثل أو BSLB الفارغة كفراغات لاستخراج عدد MESF المنقولة خصيصا لتحفيز BSLBs.
  12. احسب عدد جزيئات العلامات المنقولة إلى BSLBs بقسمة MESFs المحسوبة (المتوسطة) لكل BSLB على قيمة F / P للجسم المضاد للقياس الكمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: القياس الكمي المطلق للبروتينات على سطح APCs. (أ) مثال على قياسات القياس الخلوي للتدفق الكمي ل ICAM-1 على سطح الخلايا البائية للوزتين (Foll. Bc) والخلايا التائية المساعدة (TFH). (الأول إلى السابع) استراتيجية البوابات لتحليل CXCR5 + Bc و TFH المعزولة من اللوزتين الحنكية البشرية. تظهر استراتيجية البوابات المتسلسلة لتحديد الأحداث الفردية الحية الموجودة في نافذة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 96 لوحة ثقافة خلية جيدة على شكل حرف U مع غطاء ، ثقافة الأنسجة المعالجة ، غير بيروجينيك كوستار® 3799 لتلوين FCM والزراعة المشتركة ل BSLB والخلايا. 96 لوحة ثقافة خلية جيدة على شكل حرف V مع غطاء ، ثقافة الأنسجة المعالجة ، غير الحرارية. كوستار® 3894 لتلوين FCM للخلايا أو الخرز في التعليق. أليكسا فلور 488 NHS إستر (Succinimidyl Ester) ثيرمو فيشر العلمي ، Invitrogen™ أ 20000 أليكسا فلور 647 NHS إستر (Succinimidyl Ester) ثيرمو فيشر العلمي ، Invitrogen™ A37573 و A20006 Multiwell 6 well ثقافة الأنسجة المعالجة ببلازما الغاز المفرغ صقر 353046 لزراعة وتوسيع خلايا CD4 + و CD8 + T المنقىة. الكازين من حليب الأبقار ، مناسب للركيزة لبروتين كيناز (بعد إزالة الفسفرة) ، مسحوق منقى Dynabeads بشري T-Activator CD3 / CD28 ثيرموفيشر العلمي ، جيبكو 11132 د داينا ماج -2 ThermoFisher العلمي ، Invitrogen™ 12321 د لإزالة Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28 بأحجام أقل من 2 مل داينا ماج™ -15 ThermoFisher العلمي ، Invitrogen™ 12301 د لإزالة Dynabeads™ Human T-Activator CD3 / CD28 بأحجام أقل من 15 مل مصل الأبقار الجنيني مؤهل ، شو واحد ثيرموفيشر العلمي ، جيبكو A3160801 يحتاج إلى تعطيل الحرارة لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية مضاد للإنسان CD154 (CD40L) ، استنساخ 24-31 بيو ليجند 310815 و 310818 يرافق Alexa Fluor 488 و Alexa Fluor 647 ، على التوالي الهامستر الأرمني IgG Alexa Fluor 647 التحكم في النمط المتساوي ، استنساخ HTK888 بيو ليجند 400902 تم تسميته في المنزل باستخدام Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) إعداد BD Cytometer وتتبع الخرز شركة بيكتون ديكنسون وشركاه (BD) 641319 مسار أداء الأدوات قبل FCM الكمي

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة