اختبار تثبيط النمو المؤجل لتقييم تأثير المركبات المضادة للميكروبات المشتقة من البكتيريا

الملخص

المصدر: Moran ، J. C. et al. ، اختبار تثبيط النمو المؤجل لتحديد تأثير مضادات الميكروبات المشتقة من البكتيريا على المنافسة. J. Vis. Exp.(2016)

يعرض هذا الفيديو مقايسة تثبيط النمو المؤجل ، والتي تستخدم للتحقيق في كيفية تأثير المركبات المضادة للميكروبات التي ينتجها نوع واحد من البكتيريا على سلالة بكتيرية منافسة أخرى.

البروتوكول

يتم تكييف الطريقة التالية لاختبار سلالات المنافسين ذات السلالات المنتجة للمثبطات.

ملاحظة: يتضمن هذا البروتوكول توليد الهباء الجوي مع الثقافات البكتيرية. لا يمكن إجراء ذلك إلا في مساحة محصورة مع تنفيذ اعتبارات السلامة المعتمدة محليا. سيؤدي رش المزرعة على ألواح الأجار داخل خزانة أمان من المستوى 2 إلى تقليل تلوث ألواح الأجار والبيئة المحيطة. سيحمي هذا أيضا الباحث من استنشاق الهباء الجوي للبكتيريا التي تم رشها ، وهذا مصدر قلق كبير إذا كان الباحث يستخدم كائنات من مستوى الاحتواء 2. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة. من الأفضل تغطية المنطقة المحيطة بطبق بتري بأنسجة ماصة يمكن التخلص منها. ينصح بإزالة التلوث بعد الرش باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

< p class = "jove_title" >1. تحضير لوحات أجار

1. قم بإعداد أجار تسريب قلب الدماغ (BHI) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. قم بالتعقيم في أجار BHI عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة (psi) لمدة 20 دقيقة ، أو وفقا لتوصيات الشركة المصنعة للأوتوكلاف ، للتعقيم.
3. صب 15 مل من أجار BHI المعقم في أطباق بتري معقمة واتركها تتماسك.
   ملاحظه: تأكد من أن كل لوحة أجار لاستخدامها في الفحص تنشأ من نفس مخزون الأجار وأن هناك نفس الكمية من الأجار في كل لوحة. هذا يحد من التباين في العناصر الغذائية المتاحة وانتشار المثبطات بين الألواح مما يسمح بالمقارنة.

< ص الفئة = "jove_title" >2. تحضير مرق معقم

1. تحضير مرق BHI وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. أضف 10 مل من BHI إلى 28 مل من زجاجات زجاجية عالمية.
3. قم بالتعقيم في مرق BHI عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 20 دقيقة ، أو وفقا لتوصيات الشركة المصنعة للأوتوكلاف ، للتعقيم.
   ملاحظه: تأكد من أن جميع المرق المستخدم في الفحص ينشأ من نفس الدفعة من المرق المعقمة في نفس الوقت للحد من التباين في العناصر الغذائية التي قد تسبب تباينا في النتائج.

< p class = "jove_title" >3. تحضير زجاجة (زجاجات) مبخر معقم

قم
1. بتفكيك زجاجة المرذاذ.
2. رش عامل التنظيف النشط للسطح بنسبة 5٪ من خلال المرذاذ للتخلص من الملوثات الداخلية ، وانقع زجاجة المرذاذ والغطاء والمبخر في عامل التنظيف النشط للسطح بنسبة 5٪ طوال الليل. < / > ملاحظه: يجب استخدام القفازات ومعدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل مع عوامل التنظيف النشطة للأسطح.
3. جفف المرذاذ والغطاء والزجاجات تحت غطاء تدفق الهواء المعقم.
4. املأ الزجاجة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وأعد توصيل المرذاذ ، ورش بعض الإيثانول من خلال المرذاذ.
5. ضع الغطاء على المرذاذ وقم بتخزين الإيثانول بالداخل حتى الاستخدام.
6. قبل الاستخدام مباشرة ، اشطف الزجاجة بمرق BHI المعقم ورش المرق من خلال المرذاذ.
   ملاحظه: هذا يمنع الإيثانول من التأثير على اللقاح المضاف إلى الزجاجة في القسم 6.3.

< ص الفئة = "jove_title" >4. تحضير الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها

1. قم بوضع سلالات المنافس والمثبط على صفيحة أجار BHI معقمة واحتضانها عند 37 درجة مئوية هوائية لمدة 18 ساعة تقريبا (بين عشية وضحاها).
   ملاحظه: تنتج هذه اللوحة مخزونا من البكتيريا التي يمكن استخدامها لتكرارات متعددة خلال نفس الأسبوع عند تخزينها عند 4 درجات مئوية.
تلقيح
2. 10 مل من مرق BHI المعقم بمستعمرة واحدة من السلالة البكتيرية المنافسة المطلوبة داخل زجاجة عالمية سعة 28 مل.
3. احتضن الزجاجة العالمية عند 37 درجة مئوية بشكل هوائي طوال الليل عن طريق الرج عند 250 دورة في الدقيقة في شاكر مداري.

< p class = "jove_title" >5. الثقافة الموضعية للعزل المنتج للمثبطات

1. قم بإعداد الثقافة (المثقافة) الليلية كما هو موضح في القسم 4.
2. تأكد من جفاف ألواح الأجار تماما ، مع عدم وجود تكاثف على الغطاء ، قبل التلقيح (على سبيل المثال عن طريق احتضان اللوحة لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية) ؛ هذا يمنع اللقاح من الانتشار عبر اللوحة من موقع التلقيح.
3. الماصة 25 ميكرولتر من الثقافة الليلية على وسط ألواح الأجار. تجنب الضغط تماما على مكبس الماصة لمنع فقاعات الهواء التي ترش المزرعة عبر الأجار.
4. اترك المزرعة تجف في درجة حرارة الغرفة للحد من انتشار الثقافة. احتضان ألواح أجار عند 37 درجة مئوية بشكل هوائي طوال الليل.

< p class = "jove_title" >6. تحضير لقاح الرش لسلالة (سلالات) منافس الاختبار

1. تحضير الثقافة الليلية كما هو موضح في القسم 4. قم بتخفيف المزرعة الليلية 10 أضعاف في مرق BHI لإنتاج ما يقرب من 4 × 10⁶ وحدة تشكيل مستعمرة (CFU) ^ml-1 وتعليق OD₆₀₀ 0.3 ±0.05.
   ملاحظه: لن يعطي التخفيف بمقدار 10 أضعاف 4 × 10⁶ CFU ^ml-1 لجميع الأنواع البكتيرية ، احسب عامل التخفيف الضروري عن طريق نشر التخفيفات التسلسلية للطلاء بين 1 × ^10-1-1 × ^10-6.
2. صب المزرعة المخففة في زجاجة مبخر عطر بلاستيكية معقمة.
   ملاحظه: يجب أن يكون الحجم الإجمالي أكثر من اللازم لعدد ألواح الأجار التي يتم رشها. ما يقرب من 250 ميكرولتر لكل طبق مناسب لطبق بتري بقطر 9 سم.

فئة

7. فحص تثبيط النمو المؤجل

1. رش المزرعة من خلال كل زجاجة من زجاجات المرذاذ للتأكد من تحميل المزرعة في آلية الرش قبل الرش على الأجار.
2. من مسافة حوالي 15 سم فوق الأجار ، رش ما يقرب من 250 ميكرولتر من المزرعة المخففة (3 بخاخات من مبخر نموذجي 50 مل) على سطح الأجار بالكامل. احتضان ألواح أجار عند 37 درجة مئوية بشكل هوائي طوال الليل. كرر مع الأطباق الأخرى التي تحتوي على نفس عدد البخاخات.

< p class = "jove_title" >8. تفسير نتائج فحص تثبيط النمو المؤجل

1. قم بقياس منطقة تثبيط النمو للسلالة المنافسة التي تم رشها (الشكل 1A-C ، "X" إلى "X") بالمليمترات ، مع طرح قطر البقعة المركزية للمثبط المنتج (الشكل 1A-C ، "Y" إلى "Y").
   ملاحظة: يوضح الشكل 1E كيف يمكن عرض هذه البيانات
2. سجل درجة الوضوح لمناطق التثبيط.
   ملاحظه: هذا يشير إلى درجة التثبيط التي لوحظت. يتم عرض الأمثلة في الشكل 1A-D ، يتم اقتراح السلالات التي يمكن استخدامها للتوحيد القياسي في قسم النتائج التمثيلية. يمكن استخدام المقياس التالي لتسجيل الوضوح: درجة وضوح 0 لوصف منطقة التثبيط الكامل لنمو سلالة المنافسة. تصف الدرجة 1 منطقة تثبيط شبه كامل للنمو ، مع وجود مستعمرات فردية فقط في منطقة المقاصة. تصف الدرجة 2 منطقة مرئية من النمو المنخفض ، والنمو داخل هذه المنطقة ملتقى أو قريب من التقاء ولكن ينخفض في الكثافة بنسبة >50٪. تصف الدرجة 3 الحد الأدنى فقط من انخفاض النمو ، والنمو ملتقى ويقل بأقل من 50٪ ، ولا تزال المنطقة مرئية وقابلة للقياس. تصف الدرجة 4 عدم وجود تثبيط مرئي للنمو. تصف الدرجة 5 أن نمو السلالة المنافسة قد زاد بالقرب من السلالة المنتجة لمثبطات الاختبار. انظر الشكل 1 للحصول على أمثلة. هذه الدرجات ذاتية للمجرب.

النتائج

الشكل 1: مجموعة النتائج النوعية والكمية التي يمكن الحصول عليها من مقايسة تثبيط النمو المؤجل.يمكن أن تتراوح نتائج تثبيط النمو من (أ) التثبيط الكامل (درجة 0) ، (ب) التثبيط الجزئي (درجة 1) ، (ج) التثبيط الجزئي (درجة 2) إلى (د) عدم التثبيط (درجة 4). تشير الملصقات إلى حواف نمو السلالات المثبطة (Y) والحافة الخارجية لمناطق ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مرق تسريب القلب في الدماغ مختبر م مختبر049 وسائط غنية للأغراض العامة أجار أجار ميرك ميليبور 101614 أطباق بتري سارستيدت 82.1473.001 مبخر العطور البلاستيكية غير معروف - ارتفاع 10 سم مع زجاجة رذاذ بلاستيكية شفافة بقطر 3.5 سم مع غطاء ، تم شراؤها من قسم السفر في السوبر ماركت زجاجات عالمية لم يعد قيد الإنتاج ، BOT5006 SLS البديل زجاجة أسطوانية زجاجية سعة 28 مل (قطر 280 مم تقريبا، ارتفاع 850 مم)، قاع مسطح مع غطاء لولبي بلاستيكي ديكون 90 ديكون عامل تنظيف نشط للسطح