اختبار لتحديد السالمونيلا العصارية الخلوية والفراغية في البلاعم الأولية المصابة

الملخص

المصدر: Meunier، E.، et al. القياس الكمي للسالمونيلا العصارية الخلوية مقابل السالمونيلا الفراغية في البلاعم الأولية عن طريق النفاذية التفاضلية. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو فحصا لتحديد كمية السالمونيلا التيفيموريوم العصارية الخلوية والفراغية داخل البلاعم المشتقة من نخاع العظام باستخدام النفاذية التفاضلية. تصاب البلاعم بالسالمونيلا التي تعبر عن البروتين الفلوري ، والتي يتم استيعابها داخل بنية فجوية متخصصة تسمى الفجوة المحتوية على السالمونيلا أو SCV. تهرب مجموعة فرعية من البكتيريا من SCV وتدخل العصارة الخلوية. يتم اختراق غشاء البلازما الغني بالكوليسترول من البلاعم باستخدام الديجيتونين ، مما يترك SCV سليما. عند تصنيف البكتيريا العصارية الخلوية بجسم مضاد مميز بالفلورسنت ، يتم قياس النسبة المئوية للبكتيريا الفجوية والعصارة الخلوية باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS).

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. فحص الديجيتونين مع السالمونيلا التي تعبر عن mCherry (تحليل قائم على FACS)

1. تحضير البكتيريا
   ملاحظة: السالمونيلا من النوع البري SL1344 (مقاوم للستربتومايسين) يعبر عن mCherry من البلازميد (pFPV يشفر mCherry تحت محفز rpsM) يستخدم في هذا الفحص. لم يتم تغيير البلعمة البكتيرية والانتشار من خلال التعبير التأسيسي ل mCherry (البيانات غير معروضة).
   1. تلقيح السلالة قبل يوم واحد من الإصابة في 3 مل من وسط LB المكمل بالستربتومايسين (90 ميكروغرام / مل) و Ampicillin (100 ميكروغرام / مل ، mCherry يعبر عن ناقل المرض) في شاكر عند 37 درجة مئوية O / N.
2. خلايا الطلاء للعدوى.
   1. بذور BMDMs من النوع البري في صفيحة 24 بئرا بكثافة 1.25 × 10⁵ خلايا / بئر في 1 مل من وسط البلاعم الأولي (DMEM مكمل بنسبة 10٪ مصل عجل الجنين (FCS ، معطل بالحرارة ، 56 درجة مئوية ، 30 دقيقة) ، 1٪ 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES) ، 1٪ أحماض أمينية غير أساسية (NEAA) ، 1٪ L-Glutamine و 10٪ L929 طافي (وسط مكيف من عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) ينتج خلايا L929). تأخذ آبار البذور وفقا للجدول 1 في الاعتبار الظروف الفردية. إضافة أغطية إلى الآبار المستخدمة كعناصر تحكم (الجدول 1).
   2. احتضان الخلايا طوال الليل في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
3. تحضير البكتيريا للعدوى.
   1. في اليوم التالي ، حدد تركيز السالمونيلا في المزرعة الليلية عن طريق تخفيف المزرعة 1:10 في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وقياس OD₆₀₀ مقابل عنصر تحكم PBS فقط. هذا يضمن قياس OD₆₀₀ في النطاق الخطي لمقياس الطيف الضوئي.
   2. احسب تركيز السالمونيلا لكل مل. يقابل OD₆₀₀ من 1 1 1 ×^{10 9} بكتيريا.
   3. تمييع البكتيريا في وسط البلاعم للوصول إلى تركيز السالمونيلا 1.25 × 10⁶ خلايا / مل.
4. إصابة الخلايا بالسالمونيلا.
   1. قم بإزالة الوسط من BMDMs. أضف 1 مل من وسط البلاعم إلى آبار التحكم غير المصابة (B1-B3 ، C1-C3). أضف 1 مل من معلق السالمونيلا إلى الآبار A1 - A5 للوصول إلى تعدد العدوى (m.o.i.) من 10 بكتيريا لكل خلية.
   2. قم بالطرد المركزي للوحة لمدة 15 دقيقة عند 300 × جم عند 37 درجة مئوية لمزامنة العدوى. انقل اللوحة إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
5. قتل السالمونيلا خارج الخلية مع الجنتاميسين.
   1. بعد ساعة واحدة من الإصابة ، أخرج اللوحة من الحاضنة وأضف 0.1 مل من وسط البلاعم الذي يحتوي على 0.1 مجم / مل جنتاميسين لقتل البكتيريا خارج الخلية. أضف الجنتاميسين إلى جميع الآبار ، حتى إلى الضوابط غير المصابة ، لضمان معاملة جميع الخلايا بنفس الطريقة. انقل اللوحة إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
6. غسل الخلايا.
   1. بعد ساعتين من الإصابة ، أخرج اللوحة من الحاضنة واغسل جميع الآبار 2x ب 1 مل من DMEM العادي (مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية) واستبدله بوسط البلاعم (دافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية) يحتوي على 10 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين لمنع نمو أي بكتيريا متبقية خارج الخلية. انقل اللوحة إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
7. تحضير مخازن جديدة بالمنظفات والأجسام المضادة.
   1. قبل النقطة الزمنية المطلوبة للتحليل مباشرة ، قم بإعداد محلول مخزون جديد من الديجيتونين عند 1 مجم / مل في KHM Buffer (110 ملي أسيتات البوتاسيوم ، 20 ملي مولار HEPES ، 2 ملي ملي MgCl₂ ، درجة الحموضة 7.3). قم بتصفية المخزون وتخفيفه في المخزن المؤقت KHM إلى تركيز عمل يبلغ 50 ميكروغرام / مل من الديجيتونين. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد محلول من 0.1٪ سابونين في KHM Buffer ، والجسم المضاد المضاد للسالمونيلا مقترنا بفلورسين إيزوثيوسيانات (CSA-1-FITC) عند 1/500 ، أو مضاد كالنيكسين عند 1/100 أو إيزوميراز ثاني كبريتيد البروتين (مضاد PDI) عند 1/100 في KHM Buffer مكمل ب 3٪ ألبومين مصل بقري (BSA).
8. نفاذية الخلية.
   1. قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وغسل الآبار 3 مرات باستخدام 0.5 مل من KHM Buffer (دافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية). قم بإزالة KHM Buffer وأضف 0.25 مل KHM Buffer العادي إلى الآبار A4 و B1 / C1 ، أو KHM Buffer مع الديجيتونين إلى الآبار A1 - A3 و B2 / C2 ، أو KHM Buffer مع الصابونين إلى الآبار A5 و B3 / C3 (وفقا للجدول 1). احتضن لمدة دقيقة واحدة بالضبط في RT واغسل جميع الآبار على الفور 3x باستخدام 0.5 مل من KHM Buffer (تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية).
9. تلطيخ الأجسام المضادة الأولية.
   1. قم بإزالة KHM Buffer وأضف محاليل الأجسام المضادة الأولية (الماعز المضاد للسالمونيلا FITC ، 250 ميكرولتر / بئر ، 0.1 ميكروغرام / مل) إلى الآبار المناسبة (الشكل 1 ، الجدول 1). احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   2. اغسل الخلايا 1x مع 1 مل PBS.
10. الخلايا المصابة (الآبار A1 - A5): تحليل FACS
    1. اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام PBS وأضف 0.5 مل من PBS المثلج الذي يحتوي على 0.1٪ تريتون. انقله إلى أنبوب FACS سعة 5 مل مع غطاء مصفاة خلية لتفتيت مجاميع الخلايا. احتفظ بالعينات على الجليد.
    2. تحليل عينات FACS. باستخدام عناصر التحكم المنفذة بالكامل ، اضبط البوابة للبكتيريا الكلية بناء على التشتت الأمامي والجانبي (FSC / SSC) أولا ، وإشارة mCherry (مرشح 610 نانومتر ± 20 نانومتر).
    3. بعد ذلك ، قم بتحليل إشارة FITC في إجمالي عدد البكتيريا باستخدام عناصر التحكم المنفذة بالكامل وغير المنفذة لضبط بوابات البكتيريا العصارية الخلوية (FITC + ، mCherry +) والبكتيريا الفراغية (FITC- ، mCherry +) (الشكل 2).
    4. مع مجموعة البوابات، قم بتحليل العينات وتحديد النسبة المئوية للبكتيريا العصارية الخلوية مقابل البكتيريا الفراغية باستخدام برنامج FlowJo وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

< p class = "jove_content" > الجدول 1: مخطط الطلاء للضامة المشتقة من نخاع العظام (BMDMs) في شكل 24 بئرا للإصابة اللاحقة بالسالمونيلا ، والنفاذية ، والتلطيخ.

نفاذية تلطيخ غطاء زجاجي السالمونيلا ديجيتونين سابونين مضاد السالمونيلا مكافحة كالنيكسين مكافحة PDI A1 (عينة) -/+* + + + A2 (عينة) -/+* + + + A3 (عينة) -/+* + + + A4 (لا يوجد تحكم في النفاذية) -/+* + + A5 (التحكم الكامل في النفاذية) -/+* + + + B1 (ملطخ ب calnexin) + + B2 (ملطخ ب calnexin) + + + B3 (ملطخ ب calnexin) + + + C1 (ملطخ ل PDI) + + C2 (ملطخ ل PDI) + + + C3 (ملطخ ل PDI) + + +

النتائج

الشكل 1. التمثيل التخطيطي للبروتوكول 1. يتم اختراق الخلايا المصابة التي تحتوي على السالمونيلا إيجابية الكرز إما في الفجوات السليمة أو العصارة الخلوية بشكل تفاضلي مع الديجيتونين. السالمونيلا العصارية الخلوية ملطخة بمضاد السالمونيلا إلى جانب FITC. يتم غسل الخلايا وتحللها باستخدام Triton X-100 لتحليل FACS. لا يتم اختراق خلايا التحكم السلبية ، بينما يتم اختراق خلايا التحكم الإي...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ديجيتونين سيغما د5628 50 ميكروغرام / مل PFA مبيو 219998380 هيبس تقنيات الحياة 15630 [م] أسيتات البوتاسيوم سيغما 791733 مغنكلوريد₂ سيغما M8266 جيش صرب البوسنه سيغما أ 2153 مضاد للسالمونيلا CSA-1-FITC KPL 01-91-99-مجم 1/500 مضاد للسالمونيلا CSA-1 KPL 02-91-99-ملغ 1/500 مكافحة كالنيكسين إنزو لفساينس سبا -860 د 1/100 مكافحة PDI إنزو لفساينس سبا -890 1/100 سابونين سيغما 47036 Vectashield تركيب الوسط فيكتورلابس إتش-1200 الأجسام المضادة للأرانب -488 المجسات الجزيئية أ -11070 1/500 الجنتاميسين تقنيات الحياة 15710-49 100 ميكروغرام / مل و 10 ميكروغرام / مل تريتون X-100 بروميجا H5141 برنامج تلفزيوني جيبكو 20012-019 DMEM سيغما د6429 NEAA أميد 5-13 كيلو 00 ساعة FACS فورتيسا تقنيات BD الكشف mCherry 610 نانومتر FACS فورتيسا تقنيات BD كشف FITC 530 نانومتر