القياس في المختبر لنشاط إنزيم α-Galactosidase A وحمض α-جلوكوزيداز

الملخص

المصدر: Lukas، J.، et al. قياس الإنزيم في المختبر لاختبار استجابة المرافق الدوائي في مرض فابري وبومبي. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو القياس في المختبر لنشاط الإنزيم ل α-galactosidase A وحمض α-glucosidase في العينات باستخدام ركائز 4-Methylumbelliferyl الاصطناعية.

البروتوكول

فئة

1. حصاد الخلايا و α-galactosidase A أو قياس نشاط حمض α-جلوكوزيداز

1. حصاد الخلايا
   1. في يوم الحصاد ، قم بإزالة الخلايا من الحاضنة وشفط الوسط. اغسل الخلايا بعناية مرتين باستخدام PBS مع Ca₂+ و Mg₂ + .
      ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة لأن DGJ و DNJ مثبطات قوية ل α-galactosidase و α-glucosidase ، على التوالي ، وأي بقايا من شأنها إبطال الاختبار.
   2. أضف 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات مباشرة فوق الخلايا. اشطف الخلايا من اللوحة وانقلها إلى أنبوب تفاعل سعة 1.5 مل.

< p class = "jove_title" >2. التجانس عن طريق التجميد والذوبان

1. ضع العينات في رف رغوي مناسب ودوامة لمدة 5 ثوان لجعل التحلل أكثر كفاءة. ضع العينات بالتناوب في النيتروجين السائل لمدة 10 ثوان وفي حمام مائي بدرجة حرارة الغرفة حتى يكتمل الذوبان (5 دقائق).
2. كرر هذا الإجراء 5 مرات ثم قم بتدوير العينات لمدة 5 دقائق عند 10,000 × جم. احتفظ بالمادة الطافية والماصة في أنبوب تفاعل جديد.

< ص الفئة = "jove_title" >3. تحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة حمض البيسنشونيك (BCA)

1. قم بإعداد أنبوب جديد لكل عينة تحتوي على 40 ميكرولتر من H₂O منزوع الأيونات وأضف 10 ميكرولتر من العينة. امزج المحلول عن طريق الدوامة لفترة وجيزة وانقل 10 ميكرولتر إلى تجويف من صفيحة 96 بئر (كل عينة في ثلاث نسخ). تمييع محلول مخزون الألبومين البقري في مصل الدم (BSA) 2 ملغم/مل في H₂O منزوع الأيونات على النحو التالي للحصول على منحنى قياسي: 50 ميكرولتر H₂O/50 ميكرولتر BSA؛ 60 ميكرولتر H₂O / 40 ميكرولتر BSA ؛ 70 ميكرولتر H₂O / 30 ميكرولتر BSA ؛ 80 ميكرولتر H₂O / 20 ميكرولتر BSA ؛ 90 ميكرولتر H₂O / 10 ميكرولتر BSA ؛ 100 ميكرولتر H₂O.
2. ابدأ التفاعل بإضافة 200 ميكرولتر من كاشف BCA (الكاشف A والكاشف B مختلط بنسبة 50: 1) واحتضانه لمدة ساعة واحدة في الظلام عند 37 درجة مئوية تحت تحريض طفيف على شاكر مداري (300 دورة في الدقيقة). قم بقياس الامتصاص عند 560 نانومتر في قارئ لوحة.
   ملاحظه: تحتوي العينات عادة على ما بين 1 و 1.5 ميكروغرام بروتين لكل ميكرولتر.

< p class = "jove_title" >4. قياس نشاط الإنزيم باستخدام ركائز 4-Methylumbelliferyl الاصطناعية (4-MUG)

قم
1. بتخفيف الكمية المحسوبة لكل عينة وماصة إلى أنابيب تفاعل جديدة سعة 1.5 مل للحصول على 0.05 (ل α-galactosidase A) أو 0.5 (لمحاليل البروتين الحمضية α-glucosidase) ميكروغرام من البروتين/ميكرولتر. دوامة العينات لمدة 5 ثوان مرة أخرى وسحب 10 ميكرولتر من هذا التخفيف في صفيحة 96 بئرا (كل عينة مكررة).
2. ابدأ التفاعل بإضافة 20 ميكرولتر من محلول الركيزة المعني:
   بالنسبة ل α-galactosidase A: 2 ملي مولار 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside (4-MU-gal) في 0.06 M من سترات الفوسفات ، درجة الحموضة 4.7.
   بالنسبة لحمض α-جلوكوزيداز: 2 ملي مولار 4-ميثيل أومبليليفيريل α-د-جلوكوبيرانوزيد (4-MU-glu) في 0.025 م أسيتات الصوديوم ، درجة الحموضة 4.0.
3. احتضان تفاعلات الإنزيم لمدة ساعة واحدة في الظلام عند 37 درجة مئوية تحت تحريض طفيف على شاكر مداري (300 دورة في الدقيقة). قم بإنهاء التفاعل بإضافة 200 ميكرولتر من 1.0 متر ، الرقم الهيدروجيني المعدل 10.5 المخزن المؤقت للجلايسين-هيدروكسيد الصوديوم.
4. قم بإعداد منحنى قياسي ل 4-methylumbelliferone (4-MU) من مخزون 0.01 مجم / مل على النحو التالي:
   100 ميكرولتر H2O / لا 4-MU ؛ 80 ميكرولتر H2O / 20 ميكرولتر 4-MU ؛ 60 ميكرولتر H₂O / 40 ميكرولتر 4-MU ؛ 40 ميكرولتر H₂O / 60 ميكرولتر 4-MU ؛ 20 ميكرولتر H₂O / 80 ميكرولتر 4-MU ؛ لا H₂O / 100 ميكرولتر 4-MU ، ماصة 10 ميكرولتر من كل تخفيف في لوحة 96 بئر (في نسخ مكررة) وإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت 1.0 M glycine-NaOH إلى كل بئر من أجل ضبط الحجم ودرجة الحموضة.
5. قم بقياس نشاط الإنزيم في قارئ مضان مزود بمجموعة المرشحات المناسبة وتحليل البيانات باستخدام البرنامج المناسب لجهاز قارئ الفلورة.
   ملاحظه: يتم تقليل ركيزتي 4-MUG إلى 4-MU أثناء التعرض ل α-galactosidase A أو حمض α-glucosidase. تم إصدار 4-MU عبارة عن فلوروكروم ، والذي يمكن قياسه عند 360 و 465 نانومتر كأطوال موجية للإثارة والانبعاث ، على التوالي ، باستخدام قارئ مضان صفيحة دقيقة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كلوريد الصوديوم ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا 1,06,40,41,000 كلوريد البوتاسيوم ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا 1,04,93,60,500 ريال MgCl₂ × 6H₂O ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا 1,05,83,30,250 د (+) - مونوهيدرات الجلوكوز ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا 1,08,34,22,500 هيدروكسيد الصوديوم ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا 1,06,49,80,500 أسيتات الصوديوم ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا 1,06,26,40,050 HEK293H خط الخلية Invitrogen ، كارلسروه ، ألمانيا هاتف: 11631-017 أنابيب تفاعل SafeSeal ، 1.5 مل Sarstedt ، Nümbrecht ، ألمانيا 72,706 قارئ Tecan GENios Tecan, Männedorf, سويسرا ماجلان برنامج تحليل البيانات v6.6 Tecan, Männedorf, سويسرا غير